Doppelsträngige RNA (dsRNA) ELISA KIT

Bei diesem Kit handelt es sich um einen ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) mit Kopplung an das Biotin-Streptavidin-System zur quantitativen Messung von dsRNA mit einer Länge über 60 Basenpaaren (bp), unabhängig von der Sequenz.Die Platte wurde mit Anti-dsRNA-Antikörper vorbeschichtet.In der Probe vorhandene dsRNA wird hinzugefügt und bindet an die auf den Vertiefungen beschichteten Antikörper.Anschließend wird ein biotinylierter Anti-dsRNA-Antikörper hinzugefügt, der an die dsRNA in der Probe bindet.Nach dem Waschen wird HRP-Streptavidin hinzugefügt und bindet an den biotinylierten Anti-dsRNA-Antikörper.Nach der Inkubation wird ungebundenes HRP-Streptavidin weggewaschen.Anschließend wird die TMB-Substratlösung zugegeben und durch HRP katalysiert, um ein blaues Farbprodukt zu erzeugen, das sich nach Zugabe der sauren Stopplösung in Gelb ändert.Die Dichte von Gelb ist proportional zur Zielmenge der in der Platte eingefangenen dsRNA.Die Extinktion wird bei 450 nm gemessen.

Anwendung

Dieses Kit dient zur quantitativen Messung der restlichen dsRNA.

Kit-Komponenten

Lagerung und Stabilität

1. Für unbenutztes Kit: Das gesamte Kit kann während der Haltbarkeitsdauer bei 2 bis 8 °C gelagert werden.Aus Gründen der Lagerstabilität sollte starkes Licht vermieden werden.

2. Für gebrauchte Kits: Sobald die Mikrotiterplatte geöffnet ist, decken Sie nicht verwendete Vertiefungen bitte mit Plattenversiegelung ab und kehren Sie in den Folienbeutel zurück, der die Trockenmittelpackung enthält. Verschließen Sie den Folienbeutel mit einem Reißverschluss und stellen Sie ihn so schnell wie möglich nach Gebrauch auf 2–8 °C zurück.Andere Reagenzien sollten so bald wie möglich nach Gebrauch wieder auf 2–8℃ gebracht werden.

Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien

1. Mikroplatten-Lesegerät mit 450 ± 10 nm Filter (besser, wenn bei 450 und 650 nm Wellenlänge detektiert werden kann).

2. Mikroplattenschüttler.

3. RNase-freie Spitzen und Zentrifugenröhrchen.

Betriebsflussdiagramm

Bevor Sie beginnen

1. Bringen Sie alle Kit-Komponenten und Proben vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18–25 °C).Wenn das Kit nicht auf einmal aufgebraucht ist, entnehmen Sie die Streifen und Reagenzien bitte nur für das aktuelle Experiment und belassen Sie die restlichen Streifen und Reagenzien im erforderlichen Zustand.

2. Waschpuffer: Verdünnen Sie 40 ml 20-fach konzentrierten Waschpuffer mit 760 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser, um 800 ml 1-fach Waschpuffer herzustellen.

3. Standard: Vor Gebrauch die Stammlösung kurz schleudern oder zentrifugieren.Die Konzentration der vier bereitgestellten Standards beträgt 5 ng/μL.Für UTP- und pUTP-dsRNA-Standards verdünnen Sie bitte die Stammlösung mit STE-Puffer auf 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL, um die Standardkurve zu zeichnen.Für N1-Me-pUTP-dsRNA-Standards verdünnen Sie bitte die Stammlösung auf 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 pg/μL mit STE-Puffer, um die Standardkurve zu zeichnen.Für den 5-OMe-UTP-dsRNA-Standard verdünnen Sie bitte die Stammlösung auf 4,2,1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0 pg/μL mit STE-Puffer, um die Standardkurve zu zeichnen.Wir empfehlen, dass Standards wie in den folgenden Diagrammen verdünnt werden können:

4. Biotinylierter Nachweisantikörper und HRP-Streptavidin-Arbeitslösung: Die Stammlösung vor der Verwendung kurz schleudern oder zentrifugieren.Verdünnen Sie sie mit Verdünnungspuffer auf die Arbeitskonzentration.

5. TMB-Unterzustand: Saugen Sie die benötigte Lösungsdosis mit sterilisierten Spitzen auf und geben Sie die restliche Lösung nicht erneut in die Durchstechflasche.Der TMB-Substrat ist lichtempfindlich. Setzen Sie den TMB-Substrat nicht über längere Zeit dem Licht aus.

Protokoll verwenden

1. Bestimmen Sie die Anzahl der für den Test erforderlichen Streifen.Stecken Sie die Streifen zur Verwendung in die Rahmen.Verbleibende Plattenstreifen, die in diesem Test nicht verwendet werden, sollten mit Trockenmittel wieder in den Beutel gepackt werden.Zur gekühlten Lagerung den Beutel gut verschließen.

2. Geben Sie jeweils 100 μl der Standard-, Leerwert- und Probenverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen.Mit dem Plattenversiegeler abdecken.1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 500 U/min inkubieren.Für einen genauen Test sollten die Proben mit STE-Puffer auf die entsprechende Konzentration verdünnt werden.

3. Waschschritt: Die Lösung absaugen und mit 250 μl Waschpuffer in jede Vertiefung waschen und 30 Sekunden lang stehen lassen.Entsorgen Sie den Waschpuffer vollständig, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier legen.Insgesamt 4 Mal waschen.

4. 100 μl biotinylierte Detektionsantikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung geben.Mit dem Plattenversiegeler abdecken.1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 500 U/min inkubieren.

5. Waschschritt wiederholen.

6. 100 μl HRP-Streptavidin-Arbeitslösung in jede Vertiefung geben.Mit dem Plattenversiegeler abdecken.30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 500 U/min inkubieren.

7. Wiederholen Sie den Waschschritt erneut.

8. 100 μl TMB-Substratlösung in jede Vertiefung geben.Mit dem Plattenversiegeler abdecken.30 Minuten bei RT inkubieren. Vor Licht schützen.Durch die Zugabe der Substratlösung wird die Flüssigkeit blau.

9. 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung geben.Durch die Zugabe der Stopplösung wird die Flüssigkeit gelb.Starten Sie dann den Mikroplatten-Reader und führen Sie sofort die Messung bei 450 nm durch.

Berechnung der Ergebnisse

1. Mitteln Sie die doppelten Messwerte für jeden Standard, jede Kontrolle und jede Probe und subtrahieren Sie die durchschnittliche optische Dichte des Nullstandards.Erstellen Sie eine Standardkurve mit der Absorption auf der vertikalen (Y)-Achse und der dsRNA-Konzentration auf der horizontalen (X)-Achse.

2. Es wird empfohlen, die Berechnung mit computergestützter Kurvenanpassungssoftware wie Curve Expert 1.3 oder ELISA Calc in einem nichtlinearen Anpassungsmodell mit 5 oder 4 Parametern durchzuführen.

Leistung

1. Empfindlichkeit:

untere Nachweisgrenze: ≤ 0,001 pg/μL (für UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (für 5-OMe-UTP-dsRNA).

untere Bestimmungsgrenze: 0,0156 pg/μL (für UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (für N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (für 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Präzision: CV des Intra-Assays ≤10 %, CV des Inter-Assays ≤10 %

3. Erholung: 80 % ~ 120 %

4. Linearität: 0,0156–0,5 pg/μL (für UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312–1 pg/μL (für N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625–1 pg/μL (für 5-OMe-UTP-dsRNA).

Überlegungen

1. TMB-Reaktionstemperatur und -zeit sind entscheidend, bitte kontrollieren Sie sie streng gemäß der Anleitung.

2. Um eine gute Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit des Tests zu erreichen, ist ein ordnungsgemäßes Waschen der Platten zur Entfernung überschüssiger, nicht reagierter Reagenzien unerlässlich.

3. Alle Reagenzien sollten vor der Verwendung gründlich gemischt werden und Störungen während der Proben- oder Reagenzzugabe vermieden werden.

4. Wenn sich im konzentrierten Waschpuffer (20x) Kristalle gebildet haben, erwärmen Sie ihn auf 37 °C und mischen Sie vorsichtig, bis sich die Kristalle vollständig aufgelöst haben.

5. Vermeiden Sie die Analyse von Proben, die Natriumazid (NaN3) enthalten, da dies die HRP-Aktivität zerstören und zu einer Unterschätzung der dsRNA-Menge führen könnte.

6. Vermeiden Sie eine RNase-Kontamination während des Tests.

7. Standard/Probe, Nachweisantikörper und SA-HRP können auch bei RT ohne Schütteln durchgeführt werden, dies kann jedoch zu einer Verminderung der Nachweisempfindlichkeit um das Faktor 1 führen.Für diesen Fall empfehlen wir, dass UTP- und pUTP-dsRNA-Standards ab 2 pg/μL verdünnt werden sollten, N1-Me-pUTP dsRNA-Standards ab 4 pg/μL verdünnt werden sollten und 5-OMe-UTP dsRNA-Standards ab 8 pg/μL verdünnt werden sollten.Inkubieren Sie außerdem die HRP-Streptavidin-Arbeitslösung 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.Verwenden Sie keinen Kolbenschüttler, da der Kolbenschüttler zu ungenauen Ergebnissen führen kann.

Typisches Ergebnis

1. Standardkurvendaten

2. Standardkurvenberechnung

3. Liner-Erkennungsbereich: 0,0312–1 pg/μL