M-MLV Reverse Transkriptase
RevScript Reverse Transkriptase wird durch gentechnische Technologie gewonnen.Es verfügt über eine höhere cDNA-Synthesefähigkeit, thermische Stabilität und Reaktionstemperaturgrenze (bis zu 60 °C).Das synthetisierte cDNA-Produkt ist bis zu 10 kb groß.Es erhöht die Affinität der Templates und eignet sich für die reverse Transkription von RNA-Templates mit komplexer Sekundärstruktur oder Genen mit geringer Kopienzahl.
Komponenten
| Komponente | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transkriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-Puffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Lagerbedingungen
Dieses Produkt sollte 2 Jahre lang bei -25 °C bis -15 °C gelagert werden.
Einheitendefinition
Eine Einheit baut 1 nmol dTTP in 10 Minuten bei 37 °C in säureunlösliches Material ein, wobei Oligo(dT) als Primer verwendet wird.
Reaktionsaufbau
1.Denaturierung der RNA-Matrize (Dieser Schritt ist optional. Die Denaturierung der RNA-Matrize hilft, die Sekundärstrukturen zu öffnen, was die Ausbeute der Erststrang-cDNA verbessert.)
| Komponenten | Lautstärke (μL) |
| RNase-freies ddH2O | Bis 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) oder Random Primer (50 μmol/L) Oder genspezifische Primer (2 μmol/L) | 1 |
| oder 1 | |
| oder 1 | |
| RNA-Vorlage | X a |
Anmerkungen:
1) a: Gesamt-RNA: 1–5 ug oder mRNA: 1–500 ng
2) 5 Minuten bei 65 °C inkubieren, dann sofort auf Eis übertragen und 2 Minuten lang abkühlen lassen.Nach kurzer Zentrifugation die Reaktionsflüssigkeit auffangen und die Reverse-Transkriptions-Reaktionslösung wie in der folgenden Tabelle gezeigt hinzufügen.Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
1.Vorbereitung der Reaktionsmischung (20 μL Volumen)
| Komponenten | Lautstärke (μL) |
| Mischung aus vorherigem Schritt | 13 |
| 5×Puffer | 4 |
| dNTP-Mix (10 nmol/L) | 1 |
| Reverse Transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-Inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.Führen Sie die Reaktion unter folgenden Bedingungen durch:
| Temperatur (°C) | Zeit |
| 25 °Ca | 5 Minuten |
| 42 °Cb | 15-30 Minuten |
| 85 °Cc | 5 Minuten |
Anmerkungen:
1) a.Eine 5-minütige Inkubation bei 25 °C ist nur für die Verwendung der Zufallshexamere erforderlich.Bitte überspringen Sie diesen Schritt, wenn Sie Oligo (dT) verwenden.18oder genspezifischer Primer.
2) b.Die empfohlene Temperatur für die reverse Transkription beträgt 42 °C. Für Template mit komplizierten Sekundärstrukturen oder hohem GC-Gehalt wird empfohlen, die Reaktionstemperatur auf 50–55 °C zu erhöhen.
3) c.Erhitzen auf 85 °C für 5 Minuten, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren.
4) Das Produkt kann direkt in PCR- oder qPCR-Reaktionen verwendet oder zur kurzfristigen Lagerung bei -20 °C gelagert werden.Für eine langfristige Lagerung wird empfohlen, die Produkte auszurichten und bei -80 °C zu lagern.Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen.
5) Das Produkt eignet sich für einstufige RT-qPCR. Es wird empfohlen, 10–20 U Reverse Transkriptase pro 25 μL Reaktionssystem hinzuzufügen oder die Menge an Reverse Transkriptase entsprechend der tatsächlichen Situation schrittweise zu erhöhen.
Anmerkungen
1.Bitte halten Sie den Experimentierbereich sauber;Während des Betriebs sollten saubere Handschuhe und Masken getragen werden.Alle im Experiment verwendeten Verbrauchsmaterialien sollten RNase-frei sein, um eine RNase-Kontamination zu verhindern.
2.Alle Verfahren sollten auf Eis durchgeführt werden, um einen RNA-Abbau zu verhindern.
3.Um eine hohe Effizienz der reversen Transkription sicherzustellen, werden hochwertige RNA-Proben empfohlen.
4.Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.
5.Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit Laborkittel und Einweghandschuhe.
