mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase wurde von einem rekombinanten E. coli-Stamm abgeleitet, der das Gen für die Vaccinia-mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase trägt.Dieses Enzym fügt eine Methylgruppe an der 2'-O-Position des ersten Nukleotids neben der Kappenstruktur am 5'-Ende der RNA hinzu. Das Enzym nutzt S-Adenosylmethionin (SAM) als Methyldonor, um verkappte RNA zu methylieren (Kap -0), was zu einer Cap-1-Struktur führt.

Die Cap1-Struktur kann die Translationseffizienz steigern und die Expression von mRNA in Transfektions- und Mikroinjektionsexperimenten verbessern. Dieses Enzym benötigt speziell RNA mit einer m7GpppN-Kappe als Substrat.Es kann keine RNA mit pN, ppN, pppN oder GpppN am 5‘-Ende verwenden.Gekappte RNA kann durch In-vitro-Transkription unter Verwendung eines Cap-Analogs oder durch enzymatisches Capping mit dem Vaccinia-Capping-Enzym hergestellt werden.

Komponenten

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping-Reaktionspuffer

Lagerung

-25 ～- 15 ℃ für die Lagerung （ Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen vermeiden）

Speicherpuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X- 100, 50 % Glycerin.

Einheitendefinition

Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 10 pmol eines 80-nt-verkappten RNA-Transkripts in 1 Stunde bei 37 °C zu methylieren.

Qualitätskontrolltests

Exonuklease50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase mit 1 μg λ-Hind III verdauter DNA bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

Endonuklease: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase mit 1 μg λDNA bei 37 °C für 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase mit 1 μg pBR322 bei 37 °C für 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

RNase: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase mit 1,6 μg MS2-RNA für 4 Stunden bei 37 °C führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase werden auf das Vorhandensein von untersuchtE. coli genomische DNA mithilfe von TaqMan qPCR mit spezifischen PrimernE. coli 16S-rRNA-Locus.DerE. coli Die genomische DNA-Kontamination beträgt =1E. coli Genom.

Bakterien Endotoxin: LAL-Test, gemäß der Ausgabe 2020 des Chinesischen Arzneibuchs IV, Gelgrenztestmethode, allgemeine Regel (1143).Der Gehalt an bakteriellem Endotoxin sollte =10 EU/mg betragen.

Reaktionssystem und Bedingungen

1. Kombinieren Sie eine geeignete Menge Capped RNA und RNase-freies H2O in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu einem Endvolumen von 16,0 µL.

2. 5 Minuten lang auf 65 °C erhitzen und anschließend 5 Minuten lang in ein Eisbad geben.

3. Fügen Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge hinzu (zur Methylierung von Capped RNA).

weniger als 10

*10× Capping-Reaktionspuffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. 1 Stunde bei 37℃ inkubieren (2 Stunden Inkubation werden für das Zielfragment mit weniger als 200 nt empfohlen).

Anwendungen

Zur Verbesserung der mRNA-Expression während Mikroinjektions- und Transfektionsexperimenten.

Hinweise zur Verwendung

1. Vor der Reaktion sollte die RNA gereinigt und in nukleasefreiem Wasser gelöst werden. Alle Lösungen sollten kein EDTA und keine Ionen enthalten.

2. Es wird empfohlen, die Proben-RNA vor der Reaktion 5 Minuten lang auf 65 °C zu erhitzen, um die Sekundärstruktur am 5‘-Ende des Transkripts zu entfernen.Für komplexe 5´-terminale Strukturen könnte sie auf 10 Minuten verlängert werden.