PNGase F
Peptid-N-Glycosidase F (PNGase F) ist die effektivste enzymatische Methode zur Entfernung fast aller N-verknüpften Oligosaccharide aus Glykoproteinen.PNGase F ist eine Amidase, die zwischen den innersten GlcNAc- und Asparaginresten von High-Mannose-, Hybrid- und komplexen Oligosacchariden aus N-verknüpften Glykoproteinen spaltet.
Anwendung
Dieses Enzym ist nützlich für die Entfernung von Kohlenhydratresten aus Proteinen.
Vorbereitung und Spezifikation
| Aussehen | Farblose Flüssigkeit |
| Proteinreinheit | ≥95 % (von SDS-PAGE) |
| Aktivität | ≥500.000 U/ml |
| Exoglycosidase | Es konnte keine Aktivität festgestellt werden (ND) |
| Endoglykosidase F1 | ND |
| Endoglykosidase F2 | ND |
| Endoglykosidase F3 | ND |
| Endoglykosidase H | ND |
| Protease | ND |
Eigenschaften
| EG-Nummer | 3.5.1.52(Rekombinant aus Mikroorganismus) |
| Molekulargewicht | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrischer Punkt | 8. 14 |
| Optimaler pH-Wert | 7,0-8,0 |
| Optimale Temperatur | 65 °C |
| Substratspezifität | Spaltung glykosidischer Bindungen zwischen GlcNAc und Asparaginresten Abb.1 |
| Anerkennungsseiten | N-verknüpfte Glykane, sofern sie nicht α1-3-Fucose enthalten Abb. 2 |
| Aktivatoren | DTT |
| Inhibitor | Sicherheitsdatenblatt |
| Lagertemperatur | -25 ~-15 ℃ |
| Hitzeinaktivierung | Eine 20-µL-Reaktionsmischung mit 1 µL PNGase F wird durch 10-minütige Inkubation bei 75 °C inaktiviert. |
Abb. 1 Substratspezifität von PNGase F
Abb. 2 Erkennungsstellen von PNGase F.
Wenn die internen GlcNAc-Reste mit α1-3-Fucose verknüpft sind, kann PNGase F keine N-verknüpften Oligosaccharide von Glykoproteinen abspalten.Diese Modifikation kommt häufig bei Pflanzen und einigen Insekten-Glykoproteinen vor.
CKomponenten
|
| Komponenten | Konzentration |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glykoprotein-Denaturierungspuffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlykoPuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 µl |
Einheitendefinition
Eine Einheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um >95 % der Kohlenhydrate aus 10 µg denaturierter RNase B in 1 Stunde bei 37 °C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 µL zu entfernen.
Reaktionsbedingungen
1. Lösen Sie 1–20 µg Glykoprotein mit entionisiertem Wasser auf, geben Sie 1 µl 10×Glykoprotein-Denaturierungspuffer und H2O (falls erforderlich) hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 µl zu erhalten.
2.10 Minuten bei 100 °C inkubieren und auf Eis abkühlen lassen.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10 % NP-40 hinzufügen und mischen.
4.Fügen Sie 1-2 µl PNGase F und H hinzu2O (falls erforderlich), um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl herzustellen und zu mischen.
5.Die Reaktion 60 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
6.Für SDS-PAGE-Analyse oder HPLC-Analyse.
