Vaccinia-Virus-Capping-Enzym

Das Vaccinia-Virus-Capping-Enzym stammt von einem rekombinanten E. coli-Stamm, der die Gene für das Vaccinia-Virus-Capping-Enzym trägt.Dieses einzelne Enzym besteht aus zwei Untereinheiten (D1 und D12) und hat drei enzymatische Aktivitäten (RNA-Triphosphatase und Guanylyltransferase durch die D1-Untereinheit und Guaninmethyltransferase durch die D12-Untereinheit).Das Vaccinia-Virus-Capping-Enzym katalysiert wirksam die Bildung einer Cap-Struktur, die spezifisch die 7-Methylguanylat-Cap-Struktur (m7Gppp, Cap 0) an das 5′-Ende der RNA anheften kann.Die Cap-Struktur (Cap 0) spielt eine wichtige Rolle bei der mRNA-Stabilisierung, dem Transport und der Translation in Eukaryoten.Die Verkappung von RNA durch enzymatische Reaktion ist eine effektive und einfache Methode, die die Stabilität und Translation von RNA für die In-vitro-Transkription, Transfektion und Mikroinjektion erheblich verbessern kann.

Komponenten

Vaccinia-Virus-Capping-Enzym (10 U/μL)

10×Capping-Puffer

Lagerbedingungen

-25 bis 15 °C für die Lagerung (vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen).

Speicherpuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % Glycerin.

Einheitendefinition

Eine Einheit Vaccinia-Virus-Capping-Enzym ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 10 pmol GTP in ein 80-nt-Transkript in 1 Stunde bei 37 °C einzubauen.

Qualitätskontrolle

Exonuklease:10 U des Vaccinia-Virus-Capping-Enzyms mit 1 μg λ-Hind III-verdauter DNA bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese festgestellt.

Endonuklease:10 U Vaccinia-Virus-Capping-Enzym mit 1 μg λDNA bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

Nickase:10 U Vaccinia-Virus-Capping-Enzym mit 1 μg pBR322 bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

RNase:10 U Vaccinia-Virus-Capping-Enzym mit 1,6 μg MS2-RNA für 4 Stunden bei 37 °C führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

1.Coli-DNA:10 U des Vaccinia-Virus-Capping-Enzyms werden mithilfe von TaqMan qPCR mit Primern, die für den E. coli-16S-rRNA-Locus spezifisch sind, auf das Vorhandensein genomischer DNA von E. coli untersucht.Die genomische DNA-Kontamination von E. coli beträgt ≤ 1 E. coli-Genom.

2.Bakterien Endotoxin: LAL-Test, gemäß der Ausgabe 2020 des Chinesischen Arzneibuchs IV, Gelgrenztestmethode, allgemeine Regel (1143).Der Gehalt an bakteriellem Endotoxin sollte ≤10 EU/mg betragen.

Reaktionssystem und Bedingungen

1. Capping-Protokoll (Reaktionsvolumen: 20 μL)

Dieses Verfahren ist auf die Capping-Reaktion von 10 μg RNA (≥100 nt) anwendbar und kann entsprechend den experimentellen Anforderungen skaliert werden.

I) Kombinieren Sie 10 μg RNA und nukleasefreies H2O in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu einem Endvolumen von 15,0 μl.*10×Capping-Puffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) 5 Minuten lang auf 65 °C erhitzen, gefolgt von einem 5-minütigen Eisbad.

3) Fügen Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge hinzu

*10×Capping-Puffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, die RNA ist nun verschlossen und bereit für nachfolgende Anwendungen.

2. 5′-Terminal Markierungsreaktion (Reaktionsvolumen: 20 μL)

Dieses Protokoll dient der Markierung von RNA, die ein 5´-Triphosphat enthält, und kann je nach Bedarf erweitert werden.Die Effizienz der Markierungseinbindung wird durch das Molverhältnis von RNA:GTP sowie den GTP-Gehalt in RNA-Proben beeinflusst.

1) Kombinieren Sie die entsprechende Menge RNA und nukleasefreies H2O in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu einem Endvolumen von 14,0 µL.

2) 5 Minuten lang auf 65 °C erhitzen und anschließend 5 Minuten lang in ein Eisbad geben.

3)Fügen Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge hinzu.

** GTP MIX bezieht sich auf GTP und eine kleine Anzahl von Markern.Informationen zur GTP-Konzentration finden Sie unterzu Anmerkung 3.

4) 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, das RNA-5‘-Ende ist nun markiert und bereit für den Downstream

Anwendungen

1. Verschließen der mRNA vor Translationstests/In-vitro-Translation

2. Markierung des 5´-Endes der mRNA

Hinweise zur Verwendung

1.Durch Erhitzen der RNA-Lösung vor der Inkubation mit dem Vaccinia-Capping-Enzym wird die Sekundärstruktur am 5'-Ende des Transkripts entfernt.Verlängern Sie die Zeit auf 60 Minuten für Transkripte mit bekanntermaßen stark strukturierten 5-Enden.

2. Für Capping-Reaktionen verwendete RNA sollte vor der Verwendung gereinigt und in nukleasefreiem Wasser suspendiert werden.EDTA sollte nicht vorhanden sein und die Lösung sollte frei von Salzen sein.

3. Zur Markierung des 5´-Endes sollte die gesamte GTP-Konzentration etwa das 1- bis 3-fache der molaren Konzentration der mRNA in der Reaktion betragen.

4. Das Volumen des Reaktionssystems kann je nach tatsächlichem Bedarf vergrößert oder verkleinert werden.