2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat.-Nr.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) wurde entwickelt, um PCR direkt aus Proben ohne DNA-Extraktion oder Probenvorbereitung durchzuführen.Dieses Reagenz besteht aus Hot-Start-DNA-Polymerase, Uracil-DNA-Glykosylase (UNG), RNase-Inhibitor und MgCl2, dNTPs (mit dUTP statt dTTP) und Stabilisatoren für die quantitative PCR (qPCR).Dieses Reagenz weist eine hohe Inhibitortoleranz auf und kann daher direkt zum Nachweis von Proben wie Rachenabstrich, Speichel, antikoaguliertem Vollblut, Plasma und Serum ohne DNA-Extraktion eingesetzt werden.Das Reagenz verwendet proprietären Puffer für qPCR mit gemischten Enzymen aus antiinhibitorischer DNA-Polymerase und UNG-Enzym.Daher kann eine gute Amplifikation von Zielgenen in Proben, die Inhibitoren enthalten, erzielt und eine durch PCR-Reste und Aerosolverschmutzung verursachte falsch positive Amplifikation verhindert werden.Dieses Reagenz ist mit den meisten fluoreszierenden quantitativen PCR-Geräten wie Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche usw. kompatibel.
Komponenten
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG-Mischung
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Lagerbedingungen
Alle Komponenten sollten für eine Langzeitlagerung bei -20 °C und für bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.Bitte nach dem Auftauen gründlich mischen und vor der Verwendung zentrifugieren.Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen.
Fahrradprotokoll
| Schritt | Temperatur | Zeit | Zyklus |
| Verdauung | 50℃ | 2 Minuten | 1 |
| Polymerase-Aktivierung | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Denaturieren | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Glühen/Verlängern | 56-64℃ | 20-60er Jahre |
Pipettieranleitung
| Reagens | Volumen pro Reaktion | Volumen pro Reaktion | Endgültige Konzentration |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG-Mischung | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Sonden-Mischung1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Probe3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volle Lautstärke | 25 μL | 50 μL | - |
1. Die Endkonzentration des Primers beträgt normalerweise 0,2 μM.Für bessere Ergebnisse kann die Primerkonzentration im Bereich von 0,2–1 μM optimiert werden.
2. Im Allgemeinen kann die Sondenkonzentration im Bereich von 0,1–0,3 μM optimiert werden.Die optimale Konzentration der Sonde hängt vom Echtzeit-PCR-Amplifikationsgerät, der Art der Sonde und der Art der fluoreszierenden Markierungssubstanz ab.Bitte beachten Sie das Gerätehandbuch oder die spezifischen Anforderungen der einzelnen Fluoreszenzsonden.
3. Verschiedene Arten von Proben enthalten unterschiedliche Arten und Gehalte an Inhibitoren sowie unterschiedliche Kopienzahlen des Zielgens.Das Probenvolumen sollte anhand des tatsächlichen Zustands berücksichtigt werden.Nehmen Sie bei Bedarf eine Verdünnung der Probe vor, indem Sie nukleasefreies Wasser oder TE-Puffer hinzufügen.
4. Empfohlenes Volumen verschiedener Proben:
| Probe | Volumen für einen 50 μL Reaktion | Maximal Verhältnis |
| Antikoaguliertes Vollblut | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30 % |
| Serum | 10 μL | 20 % |
| Halsabstrich | 10 μL | 20 % |
| Speichel | 10 μL | 20 % |
Qualitätskontrolle
1. Funktionserkennung: Sensitivität, Spezifität und Wiederholbarkeit der qPCR.
2. Keine exogene Nukleaseaktivität: keine exogene Endonuklease und Exonukleaseverschmutzung.
Hinweise zum Produkt
1. Dieses Produkt verwendet eine neuartige Art von Hot-Start-DNA-Polymerase, die in 1–5 Minuten aktiviert werden kann. Da der Reaktionspuffer optimiert wurde, eignet es sich besser für quantitative Doppel- oder Mehrfachfluoreszenz-PCR unter Verwendung der Sondenmethode.
2. Wenn der Rn-Wert der PCR-Amplifikation zu niedrig ist oder die Amplifikation offensichtlich gehemmt ist, kann eine Verringerung der Probenmenge, eine Erhöhung des Reaktionsvolumens oder eine vorherige Verdünnung der Probe die Ergebnisse verbessern.
3. Die Entnahme von Blut, Speichel, Urin, Rachenabstrich usw. sollte den Anforderungen klinischer Kriterien entsprechen und frische Proben können verwendet werden, um den Abbau von Nukleinsäuren zu verhindern.
4. Da verschiedene Amplicons eine unterschiedliche Nutzungseffizienz gegenüber dUTP und eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber UNG aufweisen, sollten die Reagenzien optimiert werden, wenn die Nachweisempfindlichkeit bei Verwendung des UNG-Systems abnimmt.Bitte kontaktieren Sie uns bei Bedarf für technischen Support.
5. Um die Amplifikation verschleppter PCR-Produkte zwischen einstufigen Reaktionen zu vermeiden, sind für die Amplifikation ein spezieller Versuchsbereich und eine Pipette erforderlich.Tragen Sie Handschuhe und wechseln Sie diese häufig. Öffnen Sie das Reaktionsgefäß nach der PCR-Amplifikation nicht.
