5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat.-Nr.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) ist ein hochstabiler, auf Sonden basierender Einröhrchen-Mix, der für die einstufige Reverse Transkription und quantitative PCR (qRT-PCR) geeignet ist.Es unterstützt das Vormischen von Primern und Sonden und bleibt auch nach längerer Lagerung bei niedrigen Temperaturen stabil.Die zu untersuchende Probe kann direkt bei der Verwendung hinzugefügt werden, ohne dass ein zusätzlicher Röhrchenöffnen/Pipettiervorgang erforderlich ist.Dieses Produkt enthält Komponenten, z. B. Hot-Start-DNA-Polymerase, M-MLV, hitzelabile Uracil-DNA-Glykosylase (TS-UNG), RNase-Inhibitor, MgCl2, dNTPs (mit dUTP statt dTTP) und Stabilisatoren.Mit der gentechnisch veränderten Rapid Amplification Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase ist es möglich, die PCR-Amplifikation innerhalb von 20–40 Minuten abzuschließen.Dieses Reagenz verwendet einen speziellen Puffer für qPCR mit gemischten Enzymen aus antiinhibitorischem Amplifikationsenzym und UNG-Enzym.Daher kann eine gute Amplifikation der Zielgene erreicht und eine falsche Amplifikation durch PCR-Reste und Aerosolverschmutzung verhindert werden.Dieses Reagenz ist mit den meisten quantitativen Fluoreszenz-PCR-Geräten von Herstellern wie Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad und Roche kompatibel.
Komponente
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Lagerbedingungen
Alle Komponenten sollten für eine Langzeitlagerung bei -20 °C und für bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.Bitte nach dem Auftauen gründlich mischen und vor der Verwendung zentrifugieren.Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen.
Vorbereitung des qRT-PCR-Reaktionssystems
| Komponenten | 25μLSystem | 50μLSystem | Endgültige Konzentration |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Sonden-Mischunga | 1μL | 2μL | 1× |
| Template-RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Bis zu 25 μL | Bis zu 50 μL | – |
1) a. Die Endkonzentration des Primers beträgt normalerweise 0,2 μM.Für bessere Ergebnisse kann die Primerkonzentration im Bereich von 0,2–1 μM optimiert werden.Im Allgemeinen kann die Sondenkonzentration im Bereich von 0,1–0,3 μM optimiert werden.
2) b. Bei Verwendung eines schnellen PCR-Verfahrens kann eine Erhöhung der Konzentration von Primern und Sonden zu besseren Amplifikationsergebnissen führen und ihr Verhältnis sollte entsprechend optimiert werden.
3) Verschiedene Arten von Proben enthalten unterschiedliche Arten und Gehalte an Inhibitoren sowie unterschiedliche Kopienzahlen des Zielgens.Das Probenvolumen sollte anhand des tatsächlichen Zustands berücksichtigt werden.Verdünnen Sie die Probe bei Bedarf mit nukleasefreiem Wasser oder TE-Puffer.
Reaktion CBedingungen
| Regelmäßiges PCR-Verfahren | Schnelles PCR-Verfahren | ||||||
| Verfahren | Temp. | Zeit | Zyklus | Verfahren | Temp. | Zeit | Zyklus |
| Reverse Transkription | 50℃ | 10-20 Min | 1 | Reverse Transkription | 50℃ | 5 Minuten | 1 |
| Polymerase Aktivierung | 95℃ | 1-5 Min | 1 | Polymerase Aktivierung | 95℃ | 30er Jahre | 1 |
| Denaturierung | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturierung | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Glühen Und Verlängerung | 56-64℃ | 20-60er Jahre | Glühen Und Verlängerung | 56-64℃ | 3-20s | ||
Qualitätskontrolle
1.Funktionserkennung: Sensitivität, Spezifität und Wiederholbarkeit der qPCR.
2.Keine exogene Nukleaseaktivität: keine exogene Endonuklease und Exonukleaseverschmutzung.
Anmerkungen
1.Die Amplifikationsrate der schnellen DNA-Polymerase beträgt nicht weniger als 1 kb/10 s.Verschiedene PCR-Instrumente haben unterschiedliche Heiz- und Kühlgeschwindigkeiten, Temperaturkontrollmodi und Wärmeleitfähigkeit. Daher ist die Optimierung Ihrer Primer-/Sondenkonzentration und Laufmethode in Kombination mit Ihrem spezifischen schnellen PCR-Instrument von entscheidender Bedeutung.
2.Dieses Produkt ist vielseitig einsetzbar und eignet sich für die hochempfindliche molekulare Diagnose.Die dreistufige PCR-Methode wird für Primer mit niedriger Annealing-Temperatur oder zur Amplifikation langer Fragmente über 200 bp empfohlen.
3.Da verschiedene Amplikons eine unterschiedliche Nutzungseffizienz von dUTP und eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber UNG aufweisen, sollten die Reagenzien optimiert werden, wenn die Nachweisempfindlichkeit bei Verwendung des UNG-Systems abnimmt.Bitte kontaktieren Sie uns bei Bedarf für technischen Support.
4.Um eine Amplifikation verschleppter PCR-Produkte zu vermeiden, sind für die Amplifikation ein spezieller Versuchsbereich und eine Pipette erforderlich.Tragen Sie Handschuhe und wechseln Sie diese häufig. Öffnen Sie das PCR-Röhrchen nach der Amplifikation nicht.
