EndoFree Plasmid Maxi Kit
Dieses Kit eignet sich für die Extraktion von 150–300 ml über Nacht kultivierter Bakterienlösung unter Verwendung einer verbesserten SDS-alkalischen Lysemethode zur Lyse der Bakterien.Der Rohextrakt wird selektiv mit einem einzigartigen Endotoxinfänger kombiniert und durch Zentrifugation getrennt, um Endotoxine zu entfernen.Anschließend bindet die Kieselgelmembran unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt und niedrigem pH-Wert selektiv an die Plasmid-DNA in der Lösung.Anschließend erfolgt die Zugabe von Waschpuffer zur Entfernung von Verunreinigungen und anderen bakteriellen Bestandteilen.Schließlich wird ein Elutionspuffer mit niedrigem Salzgehalt und hohem pH-Wert verwendet, um reine Plasmid-DNA von der Siliziummatrixmembran zu eluieren.Die Kieselgelmembran verwendet eine spezielle Adsorptionsmembran, und der Unterschied in der Adsorptionsmenge zwischen der Säule und der Säule ist sehr gering und die Wiederholbarkeit ist gut.Phenol, Chloroform und andere toxische Reagenzien sind nicht erforderlich, ebenso wenig wie Ethanol-Fällungsschritte.Mit diesem Kit können schnell 0,2–1,5 mg reine High-Copy-Plasmid-DNA mit einer Extraktionsrate von 80–90 % extrahiert werden.Das Kit verwendet eine einzigartige Prozessformel zur Entfernung von Endotoxin, der Endotoxingehalt ist extrem niedrig und der Zelltransfektionseffekt ist ausgezeichnet.Das extrahierte Plasmid könnte direkt für Enzymverdau, PCR, In-vitro-Transkription, Transformation, Sequenzierung und andere molekularbiologische Experimente verwendet werden.
Lagerbedingungen
RNaseA sollte bei -30 ~ -15℃ gelagert und bei ≤0℃ transportiert werden.
Endotoxin-Scavenger kann einen Monat lang bei 2 bis 8 °C gelagert werden, für die Langzeitlagerung bei -30 bis -15 °Cund bei ≤0℃ transportiert.
Andere Komponenten sollten bei Raumtemperatur (15 ~ 25℃) gelagert und bei Raumtemperatur transportiert werden.
Komponenten
| Komponenten | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Puffer P1 | 75 ml |
| Puffer P2 | 75 ml |
| Puffer P4 | 75 ml |
| Endotoxinfänger | 25 ml |
| Puffer-PW | 2 × 22 ml |
| Puffer-TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi-Säulen (jeweils in einem 50-ml-Sammelröhrchen) | 10 |
| Endotoxinfreies Sammelröhrchen | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, zur Entfernung von RNA.
Puffer P1:Bakteriensuspensionspuffer, fügen Sie vor der ersten Verwendung RNaseA zu Puffer P1 hinzu.
Puffer P2:Bakterienlysepuffer (enthält SDS/NaOH).
Puffer P4:neutralisierender Puffer.
Endotoxinfänger:Endotoxin effektiv aus dem rohen Plasmidextrakt entfernen.
Puffer-PW:Waschpuffer, vor dem ersten Gebrauch die vorgeschriebene Menge Ethanol zugeben.
Puffer-TB:Elutionspuffer.
FastPure DNA Maxi-Säulen:Plasmid-DNA-Adsorptionssäulen.
Sammelröhrchen 50 ml:Filtratsammelröhrchen.
Endotoxinfreies Sammelröhrchen:Plasmid-DNA-Sammelröhrchen.
Vorbereitete Materialien
Absolutes Ethanol, Isopropanol, 50-ml-Rundbodenzentrifugenröhrchen und 50-ml-Endotoxin-freiZentrifugenröhrchen.
Anwendungen
Dieses Produkt eignet sich für die groß angelegte Extraktion von Plasmiden aus 150 - 300 ml Bakterienlösungüber Nacht kultiviert.
Experimentierprozess
1. Nehmen Sie 150 – 200 ml (nicht mehr als 300 ml) der über Nacht kultivierten Bakterienlösung und zentrifugieren Sie sie bei Raumtemperaturca. 11.000 U/min (12.000 × g) für 1 – 2 Min.Den Überstand verwerfen und Bakterien sammeln.
Δ Wenn mehr als 50 ml Bakterienlösung gesammelt werden, können die Bakterien durch Zugabe von Bakterienlösung, Zentrifugation, Verwerfen des Überstands und andere Schritte im selben 50-ml-Röhrchen gesammelt werden
mehrmals.
2. 7,5 ml Puffer P1 (bitte prüfen Sie, ob RNaseA zu Puffer P1 hinzugefügt wurde) in die Zentrifuge gebenRöhrchen mit Bakterien füllen und durch Vortexen oder Pipettieren gründlich mischen.
Δ Die vollständige Resuspension der Bakterien in diesem Schritt ist entscheidend für die Ausbeute und es sollten nach der Resuspension keine Bakterienklumpen vorhanden sein.Wenn Bakterienklumpen vorhanden sind, die nicht gründlich vermischt werden, beeinträchtigt dies die Lyse, was zu einer geringen Ausbeute und Reinheit führt.Wenn die OD600 der Bakterienlösung 0,65 beträgt, wird empfohlen, bei der Extraktion aus 150 ml Bakterienlösung 7,5 ml Puffer P1 zu verwenden;Wenn OD600 0,75 beträgt, sollten 8 ml Puffer P1 verwendet werden und die Volumina der Puffer P2 und P4 sollten entsprechend geändert werden.Wenn das Volumen der Bakterienlösung auf 200 ml erhöht wird, wird empfohlen, dieDas Volumen der Puffer P1, P2 und P4 wird proportional erhöht.
3. 7,5 ml Puffer P2 zur Bakteriensuspension aus Schritt 2 hinzufügen und 6 – 8 Minuten lang vorsichtig auf und ab mischenMal mischen und 4 – 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Δ Vorsichtig umdrehen, um gründlich zu mischen.Das Vortexen führt zur Fragmentierung der genomischen DNA, was zu genomischen DNA-Fragmenten im extrahierten Plasmid führt.Zu diesem Zeitpunkt wird die Lösung viskos und durchscheinend, was zeigt, dass die Bakterien vollständig lysiert wurden.Die Dauer sollte 5 Minuten nicht überschreiten, um eine Zerstörung der Plasmide zu vermeiden.Wenn die Lösung nicht klar ist, sind möglicherweise zu viele Bakterien vorhandenDa die Lyse unvollständig ist, sollte die Bakterienmenge entsprechend reduziert werden.
4. 7,5 ml Puffer P4 zur Bakteriensuspension aus Schritt 3 hinzufügen und sofort 6–8 Mal vorsichtig umdrehen, damit die Lösung Puffer P2 vollständig neutralisieren kann.Zu diesem Zeitpunkt sollte ein weißer flockiger Niederschlag erscheinen.Zentrifugieren Sie bei mehr als etwa 11.000 U/min (12.000 × g) für 10 – 15 Minuten, pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 50-ml-Rundbodenzentrifugenröhrchen (selbst vorbereitet) und vermeiden Sie esDen schwebenden weißen Niederschlag absaugen.
Δ Puffer P4 hinzufügen und sofort umdrehen, um gut zu vermischen.Lassen Sie das Röhrchen stehen, bis sich der weiße Niederschlag gleichmäßig in der Lösung verteilt hat, um die Bildung lokaler Niederschläge zu verhindern, die die Neutralisierung beeinträchtigen könnten.Wenn vor der Zentrifugation kein einheitlicher weißer flockiger Niederschlag vorhanden ist und der Überstand nach der Zentrifugation nicht klar ist, kann das Röhrchen seinweitere 5 Min. zentrifugiert.
5. Geben Sie das 0,1-fache Volumen (10 % des Überstandsvolumens, etwa 2,2 ml) Endotoxin-Scavenger zum Überstand aus Schritt 4 hinzu und drehen Sie ihn zum Mischen um.Geben Sie die Lösung in ein Eisbad oder legen Sie sie 5 Minuten lang in zerstoßenes Eis (oder in den Kühlschrank mit Gefrierfach), bis sich die Lösung von trüb zu klar und durchsichtig (oder still) verändertleicht trüb) und gelegentlich mehrmals mischen.
Δ Nachdem der Endotoxin-Scavenger zum Überstand hinzugefügt wurde, wird der Überstand trübe, aber dieDer Überstand sollte nach dem Abkühlen im Eisbad klar (oder leicht trüb) werden.
6. Nachdem der Überstand 10 – 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (>25℃) aufbewahrt wurde, wird er trübeseine Temperatur steigt auf Raumtemperatur.Dann sollte der Überstand zum Mischen umgedreht werden.
Δ Wenn die Raumtemperatur niedriger ist oder Sie die Extraktionszeit verkürzen möchten, kann der Überstand in einem 37–42 °C warmen Wasserbad für 5–10 Minuten inkubiert werden und der nächste Schritt kann nach dem Überstand durchgeführt werdenwird trüb.
7. Zentrifugieren Sie den Überstand 10 Minuten lang bei etwa 11.000 U/min (12.000 × g) bei Raumtemperatur (die Temperatur muss >25 °C sein), um die Phase zu trennen.Die obere wässrige Phase enthält die DNA, während die untere blaue Ölphasenschicht Endotoxin und andere Verunreinigungen enthält.Übertragen Sie dieDNA-haltige wässrige Phase in ein neues Röhrchen geben undEntfernen Sie die Ölschicht.
Δ Die Temperatur während der Zentrifugation muss über 25℃ liegen, da dies bei einer effektiven Phasentrennung nicht der Fall isttreten auf, wenn die Temperatur zu niedrig ist.
Δ Wenn die Phasentrennung nicht effektiv ist, kann die Zentrifugationstemperatur auf 30℃ eingestellt werden undDie Zentrifugationszeit kann auf 15 Minuten erhöht werden.
Δ Saugen Sie nicht an der blauen Ölschicht, da diese Endotoxin und andere Verunreinigungen enthält.
Mechanismus
Neutralisierung durch Resuspensionslyse
◇ 7,5 ml Puffer P1 hinzufügen
◇ 7,5 ml Puffer P2 hinzufügen
◇ 7,5 ml Puffer P4 hinzufügen
Entfernung von Endotoxinen
◇Fügen Sie das 0,1-fache des Überstandsvolumens Endotoxin Scavenger hinzu
Binden und Waschen
◇ Das 0,5-fache Volumen Isopropanol zugeben
◇ 10 ml Puffer PW hinzufügen
◇ 10 ml Puffer PW hinzufügen
Elution
◇ 1 – 2 ml Buffer TB oder endotoxinfreies ddH2O hinzufügen
