M-MLV Neoscript Reverse Transkriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ist eine Reverse Transkriptase, die durch Mutationsscreening des M-MLV-Gens des Ursprungs und der Expression des Moloney-Maus-Leukämievirus in E. coli gewonnen wird.Das Enzym entfernt die RNase-H-Aktivität, weist eine höhere Temperaturtoleranz auf und ist für die reverse Transkription bei hohen Temperaturen geeignet.Daher ist es hilfreich, die ungünstigen Auswirkungen der RNA-Hochstruktur und unspezifischer Faktoren auf die cDNA-Synthese zu eliminieren, und weist eine höhere Stabilität und Fähigkeit zur Reverse-Transkriptions-Synthese auf.Das Enzym weist eine höhere Stabilität und Fähigkeit zur Reverse-Transkriptions-Synthese auf.
Komponenten
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transkriptase
2.5 × Erststrangpuffer (optional)
* 5 × Erststrangpuffer enthält kein dNTP, bitte fügen Sie dNTPs hinzu, wenn Sie das Reaktionssystem vorbereiten
Empfohlene Anwendung
1.Einstufige qRT-PCR.
2.Nachweis von RNA-Viren.
Lagerbedingungen
-20 °C für Langzeitlagerung, vor Gebrauch gut mischen, häufiges Einfrieren und Auftauen vermeiden.
Einheitendefinition
Eine Einheit integriert 1 nmol dTTP in 10 Minuten bei 37 °C unter Verwendung von Poly(A)·oligo(dT)25als Vorlage/Grundierung.
Qualitätskontrolle
1.Elektrophoretische Reinheit der SDS-PAGE größer als 98 %.
2.Amplifikationsempfindlichkeit, Chargenkontrolle, Stabilität.
3.Keine exogene Nukleaseaktivität, keine exogene Endonuklease oder Exonukleasekontamination
Reaktionsaufbau für die erste Kettenreaktionslösung
1.Vorbereitung der Reaktionsmischung
| Komponenten | Volumen |
| Oligo(dT)12-18 Grundierung oder Random PrimerA Oder genspezifische Primerb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Template-RNA | Gesamt-RNA ≤ 5 μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-freies dH2O | Auf 10 μL |
Anmerkungen:a/b: Bitte wählen Sie entsprechend Ihren experimentellen Anforderungen verschiedene Arten von Primern aus.
2.5 Minuten lang auf 65 °C erhitzen und 2 Minuten lang schnell auf Eis abkühlen lassen.
3.Fügen Sie dem obigen System die folgenden Komponenten hinzu, bis ein Gesamtvolumen von 20 µL erreicht ist, und mischen Sie vorsichtig:
| Komponenten | Lautstärke (μL) |
| 5 × Erststrangpuffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-Inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-freies dH2O | Bis 20 μL |
4. Bitte führen Sie die Reaktion gemäß den folgenden Bedingungen durch:
(1) Wenn Random Primer verwendet wird, sollte die Reaktion 10 Minuten lang bei 25 °C und dann 30 bis 60 Minuten lang bei 50 °C durchgeführt werden.
(2) Wenn Oligo dT oder spezifische Primer verwendet werden, sollte die Reaktion 30 bis 60 Minuten lang bei 50 °C durchgeführt werden.
5.5 Minuten lang auf 95 °C erhitzen, um Neoscript Reverse Transkriptase zu inaktivieren und die Reaktion zu beenden.
6.Reverse Transkriptionsprodukte können direkt in der PCR-Reaktion und der quantitativen Fluoreszenz-PCR-Reaktion verwendet oder für längere Zeit bei -20 °C gelagert werden.
PCR RReaktion:
1.Vorbereitung der Reaktionsmischung
| Komponenten | Konzentration |
| 10 × PCR-Puffer (dNTP-frei, Mg²+-frei) | 1× |
| dNTPs (10 mM je dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq-DNA-Polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2–1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2–1 μM |
| VorlageA | ≤10 % Erstkettenreaktionslösung (2 μL) |
| ddH2O | Auf 50 μL |
Anmerkungen:a: Wenn zu viel Lösung für die erste Kettenreaktion hinzugefügt wird, kann die PCR-Reaktion gehemmt werden.
2.PCR-Reaktionsverfahren
| Schritt | Temperatur | Zeit | Fahrräder |
| Vordenaturierung | 95℃ | 2-5 Min | 1 |
| Denaturierung | 95℃ | 10-20 Sek | 30-40 |
| Glühen | 50-60℃ | 10-30 Sek | |
| Verlängerung | 72℃ | 10-60 Sek |
Anmerkungen
1.Geeignet für die Optimierung der Reverse-Transkriptionstemperatur im Bereich von 42℃~55℃.
2.Es hat eine bessere Stabilität und ist für die Amplifikation der reversen Transkription bei hohen Temperaturen geeignet.Darüber hinaus ist es günstig für die effiziente Durchquerung komplexer Strukturbereiche der RNA.Auch daseignet sich für den einstufigen Multiplex-Fluoreszenz-quantitativen RT-PCR-Nachweis.
3.Gute Kompatibilität mit verschiedenen PCR-Amplifikationsenzymen und geeignet für hochempfindliche RT-PCR-Reaktionen.
4.Geeignet für eine hochempfindliche einstufige quantitative Fluoreszenz-RT-PCR-Reaktion, die die Nachweisrate niedriger Template-Konzentrationen wirksam verbessert.
5.Geeignet für den Aufbau einer cDNA-Bibliothek.
