RNase-Inhibitor
Muriner RNase-Inhibitor ist ein rekombinanter muriner RNase-Inhibitor, der aus E. coli exprimiert und gereinigt wird.Es bindet durch nichtkovalente Bindung im Verhältnis 1:1 an RNase A, B oder C, hemmt dadurch die Aktivität der drei Enzyme und schützt die RNA vor dem Abbau.Es ist jedoch nicht wirksam gegen RNase 1, RNase T1, S1-Nuklease, RNase H oder RNase aus Aspergillus.Der murine RNase-Inhibitor wurde mittels RT-PCR, RT-qPCR und IVT-mRNA getestet und war mit verschiedenen kommerziellen Reverse-Transkriptasen, DNA-Polymerasen und RNA-Polymerasen kompatibel.
Im Vergleich zu menschlichen RNase-Inhibitoren enthält muriner RNase-Inhibitor keine zwei Cysteine, die sehr empfindlich auf Oxidation reagieren, was zur Inaktivierung des Inhibitors führt.Dadurch ist es bei niedrigen DTT-Konzentrationen (weniger als 1 mM) stabil.Aufgrund dieser Funktion eignet es sich für den Einsatz bei Reaktionen, bei denen hohe DTT-Konzentrationen die Reaktion beeinträchtigen (z. B. Echtzeit-RT-PCR).
AAnwendung
Dieses Produkt kann in jedem Experiment eingesetzt werden, bei dem eine RNase-Interferenz zur Vermeidung des RNA-Abbaus möglich ist, wie zum Beispiel:
1.Synthese des ersten cDNA-Strangs, RT-PCR, RT-qPCR usw.
2.Schützt RNA vor dem Abbau während der In-vitro-Transkription/-Translation (z. B. In-vitro-Virusreplikationssystem).
3.Hemmung der RNase-Aktivität während der RNA-Trennung und -Reinigung.
Lagerbedingungen
Das Produkt kann bei -25 bis 15 °C gelagert werden und ist 2 Jahre lang gültig.
Speicherpuffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT und 50 % Glycerin.
Einheitendefinition
Die Menge an murinem RNase-Inhibitor, die erforderlich ist, um die Aktivität von 5 ng Ribonuklease A um 50 % zu hemmen, wurde als eine Einheit (U) definiert.
Molekulargewicht von Protein
Das Molekulargewicht des murinen RNase-Inhibitors beträgt 50 kDa.
Qualitätskontrolle
Exonuklease Aktivität:
40 U muriner RNase-Inhibitor mit 1 μg λ-Hind III verdauter DNA bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
Endonukleaseaktivität:
40 U muriner RNase-Inhibitor mit 1 μ g λ-DNA bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
Nicken Aktivität:
40 U muriner RNase-Inhibitor mit 1 μg pBR322 bei 37 °C über 16 Stunden führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
RNase Aktivität:
40 U muriner RNase-Inhibitor mit 1,6 μg MS2-RNA für 4 Stunden bei 37 °C führen zu keinem Abbau, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
E.Coli-DNA:
40 U muriner RNase-Inhibitor werden mithilfe von TaqMan qPCR mit Primern, die für den E. coli 16S-rRNA-Locus spezifisch sind, auf das Vorhandensein genomischer E. coli-DNA untersucht.Die genomische DNA-Kontamination von E. coli beträgt ≤ 0,1 pg/40 U.
NAnmerkungs
1. Heftiges Oszillieren oder Rühren führt zur Inaktivierung des Enzyms.
2. Der optimale Temperaturbereich dieses Inhibitors lag bei 25–55 °C und er wurde bei 65 °C und darüber inaktiviert.
3. Die Aktivitäten von RNase H, RNase 1 und RNase T1 wurden durch murinen RNase-Inhibitor nicht gehemmt.
4. Die Hemmung der RNase-Aktivität wurde in einem weiten pH-Bereich festgestellt (pH 5–9 waren alle aktiv), und die höchste Aktivität wurde bei pH 7–8 beobachtet.
5. Da Ribonukleasen typischerweise unter denaturierenden Bedingungen ihre Aktivität behalten, muss darauf geachtet werden, eine Denaturierung von RNase-Inhibitormolekülen zu vermeiden, die mit einer Ribonuklease einen Komplex gebildet haben.Um die Freisetzung aktiver Ribonuklease zu verhindern, sollten Temperaturen über 50 °C und hohe Konzentrationen von Harnstoff oder anderen Denaturierungsmitteln vermieden werden.
