Pflanzendirektes PCR-Kit

Kat.-Nr.: HCR2020A

Das Plant Direct PCR Kit eignet sich für die direkte Amplifikation von Pflanzenblättern, Samen usw. und kann für das Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenproben verwendet werden, die keine Polysaccharide und Polyphenole enthalten.Die auf der gerichteten Evolution basierende direkte Amplifikations-DNA-Polymerase weist eine überlegene Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren in Pflanzen auf.Dabei bleibt die hohe Amplifikationsleistung erhalten, die für die Amplifikation von DNA-Fragmenten innerhalb von 5 kb geeignet ist.Der einzigartige Lysepuffer A im Kit kann zur Lyse von frischem oder gefrorenem Pflanzengewebe verwendet werden.Es ist einfach zu bedienen und das Lysat kann ohne Reinigung als Vorlage für die Amplifikation verwendet werden.Das System enthält Schutzmittel, die eine effektive Amplifikation von Rohproben nach wiederholtem Einfrieren und Auftauen ermöglichen.Beim 2 × Plant Direct Master Mix müssen nur Primer und Templates hinzugefügt werden, um die Amplifikationsreaktion durchzuführen. Dadurch werden die Pipettiervorgänge reduziert und der Nachweisdurchsatz sowie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert.

Komponenten

*Plant Direct Lysis Buffer B ist ein optionales Reagenz, das zur Neutralisierung von Plant Direct Lysis Buffer A verwendet wird, um die Lagerzeit von Proben zu verlängern.Es kann entsprechend der tatsächlichen Situation verwendet werden.

Lagerbedingungen

2 × Plant Direct Master Mix, bei -30 ~ -15℃ lagern und wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden;Plant Direct Lysis Buffer, bei -30 ~ -15℃ oder 2 ~ 8℃ lagern.

Experimentierprozess

Probenverarbeitung–Pflanzenblatt

Direkte Methode:Es wird empfohlen, junge Blätter zu verwenden.Verwenden Sie einen Locher mit einem festen Durchmesser von 0,5 – 3 mm, um eine kleine und gleichmäßige Probe zu erhalten, und geben Sie die Probe dann direkt in das PCR-System (ein 50-μl-System wird empfohlen).Beachten Sie, dass sich die Probe in der PCR-Lösung befindet und nicht an der Röhrchenwand anliegt.Wenn die direkte PCR zur Amplifikation langer Fragmente und komplexer Proben verwendet wird, kann die Verwendung einer Probe mit einem kleineren Durchmesser (0,5 – 1 mm) als Vorlage helfen, bessere Ergebnisse zu erzielen.

Mahl-Lyse-Methode:Es wird empfohlen, junge Blätter zu verwenden.Nehmen Sie ein kleines Stück Blatt (ca. 1–3 mm Durchmesser), geben Sie es in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab und zermahlen Sie es so weit wie möglich (dieser Schritt kann durch Zusammendrücken des Blattes mit einer 100 μl-Pipettenspitze durchgeführt werden). um die Probe zu zerdrücken).Wenn größere Mengen Blattgewebe verwendet werden (nicht mehr als 7 mm), erhöhen Sie das Volumen des Verdünnungspuffers auf 50 μl.Nachdem die Blätter zermahlen sind, sollte die Lösung grün erscheinen.Nach einer kurzen Zentrifugation 1 μl des Überstands als Reaktionsvorlage zum PCR-System hinzufügen.

Methode der thermischen Lyse:Es wird empfohlen, junge Blätter zu verwenden.Nehmen Sie ein kleines Blattstück (ca. 1 – 3 mm Durchmesser), legen Sie es in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A und erhitzen Sie es 5 – 10 Minuten lang auf 95 °C.Bei schwer zu lysierenden Blättern kann die Lysezeit entsprechend verlängert werden (maximal 20 Min.).Wenn größere Mengen Blattgewebe verwendet werden (nicht mehr als 7 mm), erhöhen Sie das Volumen des Verdünnungspuffers auf 50 μl.Nach dem Erhitzen kurz zentrifugieren und 1 μl Überstand als Reaktionsvorlageb in das PCR-System geben.

Probenverarbeitung-Samen Pflanzen

Mahl-Lyse-Methode:Schneiden Sie Samen mit einem Durchmesser von 5 mm mit einem Skalpell ab, geben Sie sie zu 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A und zermahlen Sie die Probe mit einer Pipettenspitze oder anderen Werkzeugen.Kurz vortexen und 3 – 5 Min. bei Raumtemperatur stehen lassen.Stellen Sie sicher, dass die Samenprobe in den Verdünnungspuffer eingetaucht ist.Nach einer kurzen Zentrifugation 1 μl des Überstands als Reaktionsvorlage in das PCR-System geben.

Methode der thermischen Lyse:Schneiden Sie Samen mit einem Durchmesser von 5 mm mit einem Skalpell ab, geben Sie sie zu 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A und erhitzen Sie sie 5 – 10 Minuten lang auf 95 °C.Bei schwer zu lysierenden Blättern kann die Lysezeit entsprechend verlängert werden (maximal 30 Min.).Nach dem Erhitzen kurz zentrifugieren und 1 μl Überstand als Reaktionsvorlageb zum PCR-System geben.

A.Zum Zuschneiden von Proben geeigneter Größe können auch Scheren oder andere Werkzeuge verwendet werden;Wenn der Stempel oder die Schere wiederverwendet werden, sollten sie vor jedem Gebrauch mit 2 %iger Natriumhypochloritlösung gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu verhindern.

B.Stellen Sie sicher, dass der Plant Direct Lysis Buffer vor der Verwendung vollständig geschmolzen ist.Wenn der Puffer viskos ist oder Ausfällungen aufweist, kann er vor der Verwendung auf 37 °C erhitzt werden, um ihn vollständig zu schmelzen.

C.Das Templatvolumen im Reaktionssystem kann entsprechend dem Unterschied im Volumen des zugesetzten Pflanzenmaterials und des Verdünnungsmittels entsprechend angepasst werden.

Pflanzendirekter Lysepuffer

Der in diesem Produkt enthaltene Plant Direct Lysis Buffer A wurde streng für die Freisetzung des Genoms der meisten Pflanzengewebe optimiert und eignet sich für die kurzfristige Lagerung roher Pflanzen bei 4℃.Wenn die Probe über einen längeren Zeitraum (z. B. 1 – 2 Monate) gelagert werden muss, wird empfohlen, den Überstand in ein neues EP-Röhrchen zu überführen und bei -20 °C zu lagern.Um die Proben stabiler zu lagern, geben Sie ein gleiches Volumen Plant Direct Lysis Buffer B zum übertragenen Überstand, mischen Sie gut und lagern Sie es bei -20 °C.Die stabile Lagerzeit variiert je nach Pflanzenproben und -zustand.

Reaktionssystem

A.Es enthält Mg²⁺bei einer Endkonzentration von 2 mM.

B.Es wird empfohlen, für jeden Primer eine Endkonzentration von 0,4 μM zu verwenden.Übermäßiger Einsatz von Primern führt zu einer erhöhten unspezifischen Amplifikation.

C.Die Menge der verwendeten Probe kann je nach tatsächlicher Situation angepasst werden.Die in einer einzelnen Reaktion verwendete Menge an roher lysierter Probe kann zwischen 2 % und 20 % des Gesamtvolumens der Reaktion eingestellt werden.Die Verwendung zu vieler Proben kann zu einem Amplifikationsfehler führen.

Reaktionsprogramm

A.Die anfängliche Denaturierung (98 °C, 5 Min.) fördert die Lyse des Pflanzengewebes und setzt genomische DNA frei, die für die PCR-Amplifikation verwendet werden kann.Verkürzen Sie nicht die Zeit und verringern Sie nicht die Temperatur.

B.Es wird empfohlen, ihn auf den Tm-Wert des Primers oder 2 bis 4 °C höher als den Tm-Wert einzustellen.Die in diesem Produkt verwendete direkte Amplifikations-DNA-Polymerase unterscheidet sich von der herkömmlichen Taq-DNA-Polymerase und stellt besondere Anforderungen an die Reaktions-Annealing-Temperatur. Durch die Verwendung einer hohen Annealing-Temperatur kann die unspezifische Amplifikation wirksam reduziert und die Amplifikationseffizienz verbessert werden.Bei komplexen Templaten kann eine effiziente Amplifikation durch Anpassen der Annealing-Temperatur und Verlängern der Verlängerungszeit erreicht werden.

C.Wenn die Länge des Amplifikationsprodukts ≤1 kb beträgt, wird die Verlängerungszeit auf 30 Sek./kb eingestellt;Wenn die Länge des Amplifikationsprodukts > 1 kb beträgt, wird die Verlängerungszeit auf 60 Sek./kb eingestellt.

D.Bei komplexen Proben oder Proben mit geringer Amplifikationsausbeute kann die Anzahl der Zyklen entsprechend auf 40–50 Zyklen erhöht werden.

Anwendungen

Es eignet sich für die direkte Amplifikation von Pflanzengeweben und das Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenproben, die keine Polysaccharide und Polyphenole enthalten.

Anmerkungen

Nur für Forschungszwecke.Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren geeignet.

1. Für die Amplifikation roher Pflanzen oder die direkte Amplifikation wird empfohlen, vor Beginn des Experiments gereinigte genomische DNA als Positivkontrolle zu verwenden, um sicherzustellen, dass das System, die Primer und die Abläufe korrekt sind.

2. Die in diesem Kit verwendete direkte Amplifikations-DNA-Polymerase weist eine starke Korrekturleseaktivität auf.Wenn eine TA-Klonierung durchgeführt werden muss, wird empfohlen, die DNA vor der Zugabe von Adenin zu reinigen.

3. Anleitung zum Primer-Design:

A.Es wird empfohlen, dass die letzte Base am 3′-Ende des Primers G oder C sein sollte.

B.Aufeinanderfolgende Fehlpaarungen sollten in den letzten 8 Basen am 3′-Ende des Primers vermieden werden.C.Vermeiden Sie Haarnadelstrukturen am 3′-Ende des Primers.

D.Unterschiede im Tm-Wert des Vorwärts-Primers und des Rückwärts-Primers sollten nicht mehr als 1℃ betragen und der Tm-Wert sollte auf 60 ~ 72℃ eingestellt werden (zur Berechnung des Tm-Wertes wird Primer Premier 5 empfohlen).

e.Zusätzliche zusätzliche Primersequenzen, die nicht mit der Vorlage übereinstimmen, sollten bei der Berechnung des Primer-Tm-Werts nicht berücksichtigt werden.

F.Es wird empfohlen, dass der GC-Gehalt des Primers 40–60 % beträgt.

G.Die Gesamtverteilung von A, G, C und T im Primer sollte möglichst gleichmäßig sein.Vermeiden Sie die Verwendung von Regionen mit hohem GC- oder AT-Gehalt.

H.Vermeiden Sie das Vorhandensein komplementärer Sequenzen von 5 oder mehr Basen entweder innerhalb des Primers oder zwischen zwei Primern und vermeiden Sie das Vorhandensein komplementärer Sequenzen von 3 oder mehr Basen am 3′-Ende von zwei Primern.

ich.Verwenden Sie die NCBI BLAST-Funktion, um die Spezifität des Primers zu überprüfen und eine unspezifische Amplifikation zu verhindern.