Proteinase K mNGS (flüssig)
Proteinase K ist eine stabile Serinprotease mit breiter Substratspezifität.Es baut viele Proteine im nativen Zustand ab, selbst in Gegenwart von Detergenzien.Hinweise aus Kristall- und Molekülstrukturstudien deuten darauf hin, dass das Enzym zur Subtilisinfamilie mit einer katalytischen Triade im aktiven Zentrum gehört (Asp39-Sein69-Ser224).Die vorherrschende Spaltungsstelle ist die Peptidbindung neben der Carboxylgruppe aliphatischer und aromatischer Aminosäuren mit blockierten Alpha-Aminogruppen.Es wird häufig wegen seiner breiten Spezifität verwendet.Diese Proteinase K wurde speziell für mNGS entwickelt.Im Vergleich zur anderen Proteinase K enthält sie bei gleicher enzymatischer Leistung noch weniger Nukleinsäurekontaminationen, was die nachgelagerte mNGS-Anwendung besser gewährleisten könnte.
Lagerbedingungen
2-8℃ für 2 Jahre
Spezifikation
| Aussehen | Farblose bis hellbraune Flüssigkeit |
| Aktivität | ≥800 U/ml |
| Proteinkonzentration | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nichts erkannt |
| DNase | Nichts erkannt |
| RNase | Nichts erkannt |
Eigenschaften
| EG-Nummer | 3.4.21.64(Rekombinant aus Tritirachium album) |
| Isoelektrischer Punkt | 7,81 |
| Optimaler pH-Wert | 7,0- 12,0 Abb. 1 |
| Optimale Temperatur | 65 ℃ Abb. 2 |
| pH-Stabilität | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Abb. 3 |
| Thermische Stabilität | Unter 50 ℃ (pH 8,0, 30 Min.) Abb. 4 |
| Speicherstabilität | Über 90 % Aktivität für 12 Monate bei 25 °C |
| Aktivatoren | Sicherheitsdatenblatt, Harnstoff |
| Inhibitoren | Diisopropylfluorphosphat;Phenylmethylsulfonylfluorid |
Anwendungen
1. Genetisches Diagnosekit
2. RNA- und DNA-Extraktionskits
3. Extraktion von Nicht-Proteinbestandteilen aus Geweben, Abbau von Proteinverunreinigungen wie DNAImpfstoffe und Zubereitung von Heparin
4. Vorbereitung der Chromosomen-DNA durch gepulste Elektrophorese
5. Western-Blot
6. In-vitro-Diagnose mit enzymatischen glykosylierten Albuminreagenzien
Vorsichtsmaßnahmen
Tragen Sie beim Gebrauch oder Wiegen Schutzhandschuhe und Schutzbrille und sorgen Sie nach dem Gebrauch für eine gute Belüftung.Dieses Produkt kann allergische Hautreaktionen und schwere Augenreizungen verursachen.Bei Einatmen kann es zu Allergien, Asthmasymptomen oder Atemnot kommen.Kann Reizungen der Atemwege verursachen.
Einheitendefinition
Eine Einheit (U) ist definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um Casein zu hydrolysieren und 1 μmol herzustellenTyrosin pro Minute unter den folgenden Bedingungen.
Vorbereitung der Reagenzien
Reagenz I: 1 g Milchkasein wurde in 50 ml 0,1 M Natriumphosphatlösung (pH 8,0) gelöst, 15 Minuten lang in 65–70 °C warmem Wasser inkubiert, gerührt und aufgelöst, mit Wasser gekühlt, mit Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt und das Volumen fixiert 100 ml.
Reagenz II: 0,1 M Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumacetat, 0,3 M Essigsäure.
Reagenz III: 0,4 M Na2CO3Lösung.
Reagenz IV: Forint-Reagenz 5-fach mit reinem Wasser verdünnt.
Reagenz V: Enzymverdünnungsmittel: 0,1 M Natriumphosphatlösung (pH 8,0).
Reagenz VI: Tyrosinlösung: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml Tyrosin gelöst mit 0,2M HCl.
Verfahren
1. 0,5 ml Reagenz I werden auf 37 °C vorgewärmt, 0,5 ml Enzymlösung hinzugefügt, gut gemischt und bei 37 °C inkubiert37℃ für 10 Minuten.
2. Fügen Sie 1 ml Reagenz II hinzu, um die Reaktion zu stoppen, mischen Sie gut und setzen Sie die Inkubation 30 Minuten lang fort.
3. Reaktionslösung zentrifugieren.
4. Nehmen Sie 0,5 ml Überstand, geben Sie 2,5 ml Reagenz III und 0,5 ml Reagenz IV hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie bei 37 °Cfür 30min.
5. OD660wurde als OD bestimmt1;Blindkontrollgruppe: 0,5 ml Reagenz V wird als Enzymersatz verwendetLösung zur Bestimmung der OD660als OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-Tyrosin-Standardkurve: 0,5 ml L-Tyrosin-Lösung unterschiedlicher Konzentration, 2,5 ml Reagenz III, 0,5 ml Reagenz IV in einem 5 ml-Zentrifugenröhrchen, 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, OD erkennen660Für unterschiedliche L-Tyrosin-Konzentrationen erhält man dann die Standardkurve Y=kX+b, wobei Y die L-Tyrosin-Konzentration und X OD ist600.
Berechnung
2: Gesamtvolumen der Reaktionslösung (ml)
0,5: Volumen der Enzymlösung (ml)
0,5: Reaktionsflüssigkeitsvolumen, das bei der chromogenen Bestimmung verwendet wird (ml)
10: Reaktionszeit (min)
Df: Verdünnungsvielfaches
C: Enzymkonzentration (mg/ml)
Verweise
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komm.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch, 2. Auflage, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Zahlen
Feige.1 Optimum pH
100 mM Pufferlösung: pH 6,0–8,0, Na-Phosphat;pH 8,0–9,0, Tris-HCl;pH 9,0–12,5, Glycin-NaOH. Enzymkonzentration: 1 mg/ml
Abb.2 Optimale Temperatur
Reaktion in 20 mM K-Phosphatpuffer pH 8,0.Enzymkonzentration: 1 mg/ml
Abb.3 pH-Wert Stabilität
25 ℃, 16 h-Behandlung mit 50 mM Pufferlösung: pH 4,5- 5,5, Acetat;pH 6,0–8,0, Na-Phosphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH.Enzymkonzentration: 1 mg/ml
Abb.4 Thermik Stabilität
30-minütige Behandlung mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0.Enzymkonzentration: 1 mg/ml
Abb.5 Lagerung stability at 25℃
