RTL Reverse Transkriptase
RTL-Reverse-Transkriptase ist eine RNA-Templat-abhängige DNA-Polymerase, der die 3'→5'-Exonukleaseaktivität fehlt und die RNase H-Aktivität aufweist.Dieses Enzym kann RNA als Vorlage für die Synthese eines komplementären DNA-Strangs verwenden, der für die Erststrang-cDNA-Synthese, insbesondere für RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) verwendet werden kann.Im Vergleich zur RTL-Reverse-Transkriptase 1.0 ist die Empfindlichkeit deutlich verbessert, die thermische Stabilität ist stärker und die Reaktion bei 65 °C ist stabiler.RTL-Reverse-Transkriptase (glycerinfrei) kann zur Herstellung lyophilisierter Präparate, lyophilisierter RT-LAMP-Reagenzien usw. verwendet werden.
Einheitendefinition
Eine Einheit integriert 1 nmol dTTP in 20 Minuten bei 50 °C in säurefällbares Material unter Verwendung von Poly(A)·oligo(dT)25 als Template-Primer.
Komponenten
| Komponente | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transkriptase (glycerinfrei) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL-Puffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Lagerbedingungen
Transport unter 0 °C und Lagerung bei -25 °C bis -15 °C.
Qualitätskontrolle
- Restaktivität vonENuklease:Eine 50-μL-Reaktion, die 1 μg λDNA und 15 Einheiten RTL2.0 enthält und 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde, zeigt dasselbe Muster wie die Negativkontrolle durch Gelelektrophorese.
- Restaktivität vonExonuklease:Eine 50-μL-Reaktion, die 1 μg HindⅢ-verdaute λDNA und 15 Einheiten RTL2.0 enthält und 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde, zeigt dasselbe Muster wie die Negativkontrolle durch Gelelektrophorese.
- Restaktivität vonNickase:Eine 50-μL-Reaktion, die 1 μg supergeknäueltes pBR322 und 15 Einheiten RTL2.0 enthält und 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde, zeigt dasselbe Muster wie die Negativkontrolle durch Gelelektrophorese.
- Restaktivität vonRNase:Eine 10-μL-Reaktion mit 0,48 μg MS2-RNA und 15 Einheiten RTL2.0, die 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde, zeigt dasselbe Muster wie die Negativkontrolle durch Gelelektrophorese.
- E coli gDNA:Gemessen mitE colispezifische HCD-Nachweiskits, 15 Einheiten RTL2.0 enthalten weniger als 1E coliGenom.
Reaktionsaufbau
cDNA-Syntheseprotokoll
| Komponenten | Volumen |
| Template-RNA a | Optional |
| Oligo(dT) 18~25 (50 uM) oder Zufallsprimermischung (60 uM) | 2 μL |
| dNTP-Mix (jeweils 10 mM) | 1 μL |
| RNase-Inhibitor (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transkriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL-Puffer | 2 μL |
| Nukleasefreies Wasser | Bis zu 20 μL |
Anmerkungen:
1) Die empfohlene Dosierung der Gesamt-RNA beträgt 1ng~1μg
2) Die empfohlene mRNA-Dosis betrug 50 ng–100 ng
Thermo-Radfahren Bedingungen für eine Routine Reaktion:
| Temperatur (°C) | Zeit |
| 25 °Ca | 5 Minuten |
| 55 °C | 10 Minutenb |
| 80 °C | 10 Minuten |
Anmerkungen:
1) Wenn Random Primer Mix verwendet wird, ein Inkubationsschritt bei 25 °C.
2) Wenn eine Zielprimermischung verwendet wird, ein Inkubationsschritt bei 55 °C für 10–30 Minuten.
RT-LAMP-Protokoll
| Komponenten | Volumen | Endgültige Konzentration |
| Template-RNA | Optional | ≥10 Kopien |
| dNTP-Mix (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP-Primer (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3-Grundierungen (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB-Primer (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase-Inhibitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaktion |
| RTL Reverse Transkriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reaktion |
| Bst V2 DNA-Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaktion |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (insgesamt 8 mM) |
| 10×HC RTL Puffer (oder 10×HC Bst V2 Puffer) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Nukleasefreies Wasser | Bis zu 25 μL | - |
Anmerkungen:
1) Durch Vortexen mischen und kurz zentrifugieren, um es aufzufangen.Inkubation bei konstanter Temperatur bei 65 °C für 1 Stunde.
2) Die beiden Puffer sind interoperabel und haben die gleiche Zusammensetzung.
Anmerkungen
1.Dieses Produkt bildet bei Lagerung bei -20 °C einen weißen Feststoff.Nehmen Sie es bei -20°C heraus und legen Sie es für etwa 10 Minuten auf Eis.Nach dem Schmelzen kann es durch Schütteln und Mischen verwendet werden.
2. Das cDNA-Produkt kann bei -20 °C oder -80 °C gelagert oder sofort für die PCR-Reaktion verwendet werden.
3. Um eine RNase-Kontamination zu verhindern, halten Sie bitte den Versuchsbereich sauber und tragen Sie während des Betriebs saubere Handschuhe und Masken.
