Universeller SYBR GREEN qPCR-Vormix (blau)
Kat.-Nr.: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (auf Farbstoffbasis) ist eine Vorlösung für die quantitative 2-fach-Echtzeit-PCR-Amplifikation, die sich durch hohe Empfindlichkeit und Spezifität auszeichnet, eine blaue Farbe hat und den Effekt hat, die Probenzugabe zu verfolgen.Die Kernkomponente Taq-DNA-Polymerase nutzt den Antikörper-Hotstart, um unspezifische Amplifikation aufgrund des Primer-Annealings während der Probenvorbereitung wirksam zu hemmen.Gleichzeitig fügt die Formel fördernde Faktoren hinzu, um die Amplifikationseffizienz der PCR-Reaktion zu verbessern und die Amplifikation von Genen mit unterschiedlichen GC-Gehalten (30 ~ 70 %) auszugleichen, sodass die quantitative PCR eine gute lineare Beziehung in einem breiten quantitativen Bereich erreichen kann Region.Dieses Produkt enthält einen speziellen passiven ROX-Referenzfarbstoff, der für die meisten qPCR-Instrumente geeignet ist.Es ist nicht erforderlich, die ROX-Konzentration auf verschiedenen Instrumenten anzupassen.Es müssen lediglich Primer und Templates hinzugefügt werden, um das Reaktionssystem für die Amplifikation vorzubereiten.
Komponenten
Universal Blue qPCR Master Mix
Lagerbedingungen
Das Produkt wird mit Kühlakkus geliefert und kann bei -25℃~-15℃ 18 Monate lang gelagert werden.Bei der Lagerung oder Vorbereitung des Reaktionssystems ist eine starke Lichteinstrahlung zu vermeiden.
Spezifikation
| Konzentration | 2× |
| Erkennungsmethode | SYBR |
| PCR-Methode | qPCR |
| Polymerase | Taq-DNA-Polymerase |
| Art der Probe | DNA |
| Anwendungsgeräte | Die meisten qPCR-Instrumente |
| Produktart | SYBR-Vormischung für die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR |
| Bewerben Sie sich bei (Bewerbung) | Genexpression |
Anweisungen
1.Reaktionssystem
| Komponenten | Volumen(μL） | Volumen(μL） | Endgültige Konzentration |
| Universeller SYBR GREEN qPCR-Vormix | 25 | 10 | 1× |
| Vorwärtsprimer (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/L |
| Reverse Primer (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/L |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | bis zu 50 | bis zu 20 | - |
[Hinweis]: Vor Gebrauch gründlich mischen, um übermäßige Blasenbildung durch kräftiges Schütteln zu vermeiden.
a) Primerkonzentration: Die endgültige Primerkonzentration beträgt 0,2 μmol/L und kann je nach Bedarf auch zwischen 0,1 und 1,0 μmol/L angepasst werden.
b) Template-Konzentration: Wenn es sich bei dem Template um eine unverdünnte cDNA-Stammlösung handelt, sollte das verwendete Volumen 1/10 des Gesamtvolumens der qPCR-Reaktion nicht überschreiten.
c) Template-Verdünnung: Es wird empfohlen, die cDNA-Stammlösung um das 5- bis 10-fache zu verdünnen.Die optimale Menge an zugesetztem Template ist besser, wenn der durch die Amplifikation erhaltene Ct-Wert 20–30 Zyklen beträgt.
d) Reaktionssystem: Es wird empfohlen, 20 μL oder 50 μL zu verwenden, um die Wirksamkeit und Wiederholbarkeit der Zielgenamplifikation sicherzustellen.
e) Systemvorbereitung: Bitte bereiten Sie es in der Superclean-Bank vor und verwenden Sie die Spitzen und Reaktionsgefäße ohne Nukleaserückstände;Es wird empfohlen, die Spitzen mit Filterkartuschen zu verwenden.Vermeiden Sie Kreuzkontaminationen und Aerosolkontaminationen.
2.Reaktionsprogramm
Standardprogramm
| Zyklusschritt | Temp. | Zeit | Fahrräder |
| Erstdenaturierung | 95℃ | 2 Minuten | 1 |
| Denaturierung | 95℃ | 10 Sek | 40 |
| Glühen/Verlängern | 60℃ | 30 Sek.★ | |
| Schmelzkurvenstadium | Gerätestandards | 1 | |
Schnellprogramm
| Zyklusschritt | Temp. | Zeit | Fahrräder |
| Erstdenaturierung | 95℃ | 30 Sekunden | 1 |
| Denaturierung | 95℃ | 3 Sek | 40 |
| Glühen/Verlängern | 60℃ | 20 Sek.★ | |
| Schmelzkurvenstadium | Gerätestandards | 1 | |
[Hinweis]: Das Schnellprogramm ist für die überwiegende Mehrheit der Gene geeignet, und Standardprogramme können für einzelne komplexe Sekundärstrukturgene ausprobiert werden.
a) Annealing-Temperatur und -Zeit: Bitte entsprechend der Länge des Primers und des Zielgens anpassen.
b) Fluoreszenzsignalerfassung (★): Bitte stellen Sie den experimentellen Ablauf gemäß den Anforderungen in der Gebrauchsanweisung des Geräts ein.
c) Schmelzkurve: Das Standardprogramm des Geräts kann normal verwendet werden.
3. Ergebnisanalyse
Für quantitative Experimente waren mindestens drei biologische Replikate erforderlich.Nach der Reaktion müssen die Amplifikationskurve und die Schmelzkurve bestätigt werden.
3.1 Verstärkungskurve:
Die Standardverstärkungskurve ist S-förmig.Die quantitative Analyse ist am genauesten, wenn der Ct-Wert zwischen 20 und 30 liegt. Wenn der Ct-Wert unter 10 liegt, muss die Vorlage verdünnt und der Test erneut durchgeführt werden.Wenn der Ct-Wert zwischen 30 und 35 liegt, ist es notwendig, die Templatkonzentration oder das Volumen des Reaktionssystems zu erhöhen, um die Amplifikationseffizienz zu verbessern und die Genauigkeit der Ergebnisanalyse sicherzustellen.Wenn der Ct-Wert größer als 35 ist, können die Testergebnisse die Expression des Gens nicht quantitativ analysieren, können aber für eine qualitative Analyse verwendet werden.
3.2 Schmelzkurve:
Der einzelne Peak der Schmelzkurve zeigt an, dass die Reaktionsspezifität gut ist und eine quantitative Analyse durchgeführt werden kann;Wenn die Schmelzkurve Doppel- oder Mehrfachpeaks aufweist, kann keine quantitative Analyse durchgeführt werden.Die Schmelzkurve zeigt Doppelpeaks, und es muss durch DNA-Agarose-Gelelektrophorese beurteilt werden, ob der Nichtzielpeak ein Primerdimer oder eine unspezifische Amplifikation ist.Wenn es sich um ein Primer-Dimer handelt, empfiehlt es sich, die Primer-Konzentration zu reduzieren oder Primer mit hoher Amplifikationseffizienz neu zu gestalten.Wenn es sich um eine unspezifische Amplifikation handelt, erhöhen Sie bitte die Annealing-Temperatur oder entwerfen Sie die Primer mit Spezifität neu.
Anmerkungen
Bitte tragen Sie die erforderliche PSA, wie Laborkittel und Handschuhe, um Ihre Gesundheit und Sicherheit zu gewährleisten！
Dieses Produkt ist NUR für Forschungszwecke bestimmt!
