Proteinase K NGS (Pulver)

Spezifikation

Eigenschaften

Einheitendefinition

Eine Einheit NGS-Protease K ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um Casein unter Standardbestimmungsbedingungen in 1 μmol L-Tyrosin zu hydrolysieren.

 Vorbereitung der Reagenzien

Reagenz I:

Substrat: 1 % Kasein aus Rindermilchlösung: 1 g Rindermilchkasein in 50 ml 0,1 M Natriumphosphatlösung, pH 8,0, auflösen, 15 Minuten im Wasserbad auf 65–70 °C erhitzen, umrühren und auflösen, mit Wasser abkühlen, eingestellt durch Natriumhydroxid auf pH 8,0 einstellen und auf 100 ml verdünnen.

Reagenz II:

TCA-Lösung: 0,1 M Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumacetat und 0,3 M Essigsäure (1,64 g Trichloressigsäure + 1,64 g Natriumacetat + 1,724 ml Essigsäure nacheinander abwiegen, 50 ml entionisiertes Wasser hinzufügen, mit HCl auf pH 4,03 einstellen und verdünnen 100 ml).

Reagenz III:

0,4 m Natriumcarbonatlösung (4,24 g wasserfreies Natriumcarbonat abwiegen und in 100 ml Wasser auflösen)

Reagenz IV:

Folin-Phenol-Reagenz: 5-fach mit entionisiertem Wasser verdünnen.

Reagenz V:

Enzymverdünnungsmittel: 0,1 M Natriumphosphatlösung, pH 8,0.

Reagenz VI:

L-Tyrosin-Standardlösung: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-Tyrosin gelöst mit 0,2 M HCl.

Verfahren

1. Schalten Sie das UV-Vis-Spektrophotometer ein und wählen Sie die photometrische Messung.

2. Stellen Sie die Wellenlänge auf 660 nm ein.

3. Schalten Sie das Wasserbad ein, stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein und sorgen Sie dafür, dass die Temperatur 3–5 Minuten lang unverändert bleibt.

4. 0,5 ml Substrat in einem 2 ml-Zentrifugenröhrchen 10 Minuten lang im 37 °C warmen Wasserbad vorheizen.

5. Extrahieren Sie 0,5 ml verdünnte Enzymlösung für 10 Minuten in das vorgeheizte Zentrifugenröhrchen.Enzymverdünnungsmittel als Leergruppe festlegen.

6. Geben Sie unmittelbar nach der Reaktion 1,0 ml TCA-Reagenz hinzu.Gut mischen und 30 Minuten im Wasserbad inkubieren.