Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kat.-Nr.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG ist ein Spezialreagenz für qualitative und quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionen mit sondenbasierter Detektion, das speziell für Lyophilisierungsprozesse entwickelt wurde.Es enthält ein neuartiges Hot-Start-Enzym Hotstart Taq plus (DG), dessen Taq-Enzymaktivität bei Raumtemperatur versiegelt ist, wodurch die unspezifische Amplifikation, die durch unspezifisches Primer-Annealing oder Primer-Dimer-Bildung unter Niedrigtemperaturbedingungen verursacht wird, wirksam gehemmt und so verbessert wird die Spezifität der Amplifikationsreaktion.Dieses Reagenz verwendet einen optimierten qPCR-spezifischen Puffer und ein UNG/dUTP-Antikontaminationssystem, um einen schnellen Heißstart zu erreichen und so die Effizienz und Empfindlichkeit von qPCR-Reaktionen erheblich zu verbessern.Es kann gute Standardkurven in einem breiten Spektrum von Quantifizierungsbereichen erstellen und die Quantifizierung genau durchführen, wodurch falsch positive Amplifikationen durch restliche PCR-Produkte oder Aerosolkontamination effektiv verhindert werden.Dieses Reagenz ist mit den meisten fluoreszierenden quantitativen PCR-Geräten von Herstellern wie Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad und Roche usw. kompatibel und weist in lyophilisierter Form eine gute Stabilität auf.
Reagenzzusammensetzung
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+kostenlos) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×Lyoprotektivum (optional)
Lagerbedingungen
Langzeitlagerung bei -20℃;kann bei 4℃ bis zu 3 Monate gelagert werden.Vor Gebrauch gut mischen undVermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Fahrradprotokoll
| Verfahren | Temp. | Zeit | Zyklus |
| Verdauung | 50℃ | 2 Minuten | 1 |
| Polymerase-Aktivierung | 95℃ | 1~5 Min | 1 |
| Denaturieren | 95℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Glühen und Erweiterung | 56~64℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR-FlüssigkeitsreaktionssystemStammvorbereitung
|
Komposition |
25 µL Volumen |
50 µL Volumen |
Endgültige Konzentration |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+kostenlos) (DG) | 5µL | 10µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL | 0,9 µL | 4,5 mM |
| 4×Lyoprotektivum1 | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
| 25×Primer-Sonden-Mischung2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Template-DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Auf 25µL | Auf 50µL | —— |
1. Eine Endkonzentration von 0,2 μM für Primer führt normalerweise zu guten Ergebnissen;Wenn die Reaktionsleistung schlecht ist, passen Sie die Primerkonzentration je nach Bedarf im Bereich von 0,2–1 μM an.Die Sondenkonzentration wird typischerweise durch Gradientenexperimente im Bereich von 0,1–0,3 μM optimiert, um optimale Kombinationen zu finden.
2. Die Kopienzahl der Zielgene, die in verschiedenen Template-Typen enthalten sind, variiert;Bei Bedarf kann eine Gradientenverdünnung durchgeführt werden, um die optimale Templatzugabemenge zu bestimmen.
3. Dieses System kann lyophilisiert werden;Wenn Kunden dieses System ohne Gefriertrocknungsanforderungen verwenden, kann 4x Lyoschutzmittel selektiv hinzugefügt werden. Wenn gefriergetrocknete Produkte erforderlich sind, muss während der Validierung der Produktleistung in der Phase der flüssigen Reagenzien 4x Lyoschutzmittel hinzugefügt werden, um die Konsistenz mit den lyophilisierten Systemkomponenten sicherzustellen und Effekte.
Wenn das System verwendet wirdd für die Gefriertrocknung vorbereiten System as Folgendes:
| Komposition | 25µL Reaktionssystem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+kostenlos) (DG) | 5µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL |
| 4×Lyoprotektivum | 6,25 µL |
| 25×Primer-Sonden-Mischung | 1µL |
| ddH2O | Auf 18~20µL |
* Wenn andere Systeme zur Gefriertrocknung benötigt werden, wenden Sie sich bitte separat an.
Lyophilisierungsverfahrenss
| Verfahren | Temp. | Zeit | Zustand | Druck |
| Vorgefrieren | 4℃ | 30 Minuten | Halten |
1 atm |
| -50℃ | 60 Min | Kühlung | ||
| -50℃ | 180 Min | Halten | ||
| Primärtrocknung | -30℃ | 60 Min | Heizung |
Ultimatives Vakuum |
| -30℃ | 70 Min | Halten | ||
| Sekundärtrocknung | 25℃ | 60 Min | Heizung |
Ultimatives Vakuum |
| 25℃ | 300 Min | Halten |
2. Der obige Lyophilisierungsprozess dient nur als Referenz.Unterschiedliche Produkttypen und unterschiedliche Gefriertrockner haben unterschiedliche Parameter, sodass Anpassungen entsprechend den tatsächlichen Verhältnissen vorgenommen werden könnenBedingungen während des Gebrauchs.
3. Für unterschiedliche Chargengrößen der lyophilisierten Produkte können unterschiedliche Lyophilisierungsverfahren geeignet seinDaher muss bei der Verwendung in der Großserienproduktion eine ausreichende Testvalidierung durchgeführt werden.
Anleitung zur Verwendung von Lyophilisierend Pulver
1. Das lyophilisierte Pulver kurz zentrifugieren;
2. Fügen Sie dem lyophilisierten Pulver eine Nukleinsäure-Matrize hinzu und geben Sie bis zu 25 µl Wasser hinzu.
3. Durch Zentrifugieren gut mischen und auf der Maschine laufen lassen.
Qualitätskontrolle:
1. Funktionstest: Sensitivität, Spezifität, Reproduzierbarkeit der qPCR.
2. Keine exogene Nukleaseaktivität, keine exogene Endo-/Exonuklease-Kontamination.
Technische Information:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG verwendet ein neuartiges Heißstart-Enzym, das einen schnellen Heißstart innerhalb von 1–5 Minuten ermöglicht;Durch die spezielle Pufferformulierung ist es für multiplex-fluoreszierende quantitative PCR-Reaktionen geeignet.
2. Es verfügt über eine höhere Spezifität, die die Empfindlichkeit der quantitativen Fluoreszenz-PCR-Grenzwertdetektion erheblich verbessert, wodurch die Amplifikationskurven normalisiert werden und der Fluoreszenzwert bei Vorlagen mit niedriger Konzentration eine offensichtliche Verbesserung erhält, was als hochempfindliche quantitative Fluoreszenz-PCR-Nachweisreagenzien geeignet ist.
3. Für Primer mit niedrigerer Annealing-Temperatur oder Fragmente mit mehr als 200 bp wird die 3-Schritte-Methode empfohlen.
4. Die Nutzungseffizienz von dUTP und die Empfindlichkeit gegenüber dem UNG-Enzym unterscheiden sich für verschiedene Zielgene. Wenn die Verwendung des UNG-Systems daher zu einer Verringerung der Nachweisempfindlichkeit führt, sollte das Reaktionssystem angepasst und optimiert werden.Wenn Sie technische Unterstützung benötigen, wenden Sie sich bitte an unser Unternehmen.
5. Verwenden Sie vor und nach der Amplifikation spezielle Bereiche und Pipetten, tragen Sie während des Betriebs Handschuhe und ersetzen Sie diese häufig.Öffnen Sie das Reaktionsgefäß nach Abschluss der PCR nicht, um eine Kontamination der Proben durch PCR-Produkte zu minimieren.
