Wild Taq DNA-Polymerase
Taq-DNA-Polymerase ist eine thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus YT-1, die eine 5′→3′-Polymeraseaktivität und eine 5′-Flap-Endonukleaseaktivität besitzt.
Komponenten
| Komponente | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq-Puffer | 2×1 ml | 2×10 ml | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Taq-DNA-Polymerase (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Lagerbedingungen
Transport unter 0 °C und Lagerung bei -25 °C bis -15 °C.
Einheitendefinition
Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 15 nmol dNTP in 30 Minuten bei 75 °C in säureunlösliches Material einbaut.
Qualitätskontrolle
1.Proteinreinheitstest (SDS-PAGE):Die Reinheit der Taq-DNA-Polymerase betrug ≥95 %, bestimmt durch SDS-PAGE-Analyse.
2.EndOnuklease-Aktivität:Ein Minimum von 5 U Taq-DNA-Polymerase mit 1 μg λDNA über 16 Stunden bei 37 °C führt, wie festgestellt, zu keinem nachweisbaren Abbau.
3.Exonuklease-Aktivität:Ein Minimum von 5 U Taq-DNA-Polymerase mit 1 μg λ-Hind Ⅲ verdauter DNA über 16 Stunden bei 37 °C führt, wie festgestellt, zu keinem nachweisbaren Abbau.
4.Nickase-Aktivität:Mindestens 5 U Taq-DNA-Polymerase mit 1 μg pBR322-DNA über 16 Stunden bei 37 °C führen, wie festgestellt, zu keinem nachweisbaren Abbau.
5.RNase-Aktivität:Mindestens 5 U Taq-DNA-Polymerase mit 1,6 μg MS2-RNA über 16 Stunden bei 37 °C führen, wie festgestellt, zu keinem nachweisbaren Abbau.
6.E coliDNA:5 U Taq-DNA-Polymerase werden mithilfe von TaqMan qPCR mit Primern, die für den E. coli-16S-rRNA-Locus spezifisch sind, auf das Vorhandensein genomischer DNA von E. coli untersucht.Die genomische DNA-Kontamination von E. coli beträgt ≤1 Kopie.
7.PCR-Amplifikation (5,0 kb Lambda-DNA)- Eine 50-µL-Reaktion mit 5 ng Lambda-DNA und 5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase für 25 PCR-Amplifikationszyklen führt zum erwarteten 5,0-kb-Produkt.
Reaktionsaufbau
| Komponenten | Volumen |
| Template-DNAa | Optional |
| 10 μM Forward Primer | 1 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 1 μL |
| dNTP-Mix (jeweils 10 mM) | 1 μL |
| 10×Taq-Puffer | 5 μL |
| Taq-DNA-PolymeraseB | 0,25 μL |
| Nukleasefreies Wasser | Bis zu 50 μL |
Anmerkungen:
1) Die optimale Reaktionskonzentration verschiedener Template ist unterschiedlich.Die folgende Tabelle zeigt die empfohlene Vorlagenverwendung eines 50-µL-Reaktionssystems.
| DNA | Menge |
| Genomisch | 1 ng-1 μg |
| Plasmid oder Virus | 1 pg-1 ng |
2) Die optimale Konzentration der Taq-DNA-Polymerase kann bei speziellen Anwendungen zwischen 0,25 µL und 1 µL liegen.
ReaktionProgramm
| Schritt | Temperatur(°C) | Zeit | Fahrräder |
| Erstdenaturierunga | 95 ℃ | 5 Minuten | - |
| Denaturierung | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Zyklen |
| GlühenB | 60 ℃ | 15 s | |
| Verlängerung | 72 ℃ | 1 kb/min | |
| Letzte Erweiterung | 72 ℃ | 5 Minuten | - |
Anmerkungen:
1) Die anfängliche Denaturierungsbedingung ist für die meisten Amplifikationsreaktionen geeignet und kann entsprechend der Komplexität der Templatstruktur geändert werden.Wenn die Template-Struktur komplex ist, kann die Zeit vor der Denaturierung auf 5 – 10 Minuten verlängert werden, um den anfänglichen Denaturierungseffekt zu verbessern.
2) Die Glühtemperatur muss entsprechend dem Tm-Wert des Primers angepasst werden, der im Allgemeinen auf 3 bis 5 °C niedriger als der Tm-Wert des Primers eingestellt wird.Bei komplexen Templaten ist es notwendig, die Annealing-Temperatur anzupassen und die Verlängerungszeit zu verlängern, um eine effiziente Amplifikation zu erreichen.
