Uracil-DNA-Glykosylase
Uracil-DNA-Glykosylase (UNG oder UDG) ist ein rekombinanter Klon von E. coli mit einem Molekulargewicht von 25 kDa.Es katalysiert die Freisetzung von freiem Uracil aus Uracil-haltiger einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA, ist gegenüber RNA inaktiv und kann zur Verhinderung einer Kontamination von PCR-Amplifikationsprodukten verwendet werden.Das Wirkprinzip basiert auf der Tatsache, dass, wenn in der PCR-Reaktion dTTP durch dUTP ersetzt wird und ein PCR-Amplifikationsprodukt entsteht, das dU-Basen enthält, das Enzym die glykosidische Bindung von U-Basen in Einzelsträngen und Doppelsträngen selektiv aufbrechen kann DNA und bauen das PCR-Amplifikationsprodukt ab.
Empfohlene Anwendung
Verstärkung der Kontaminationsprävention
Lagerbedingungen
-20 °C für Langzeitlagerung, vor Gebrauch gut mischen, häufiges Einfrieren und Auftauen vermeiden.
Speicherpuffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilisator, 50 % Glycerin.
Einheitendefinition
Die erforderliche Enzymmenge, um 1 µg einzelsträngige DNA mit dU-Basen in 1 Stunde bei 37 °C abzubauen, beträgt 1 Einheit.
Qualitätskontrolle
1.SDS-PAGE-Elektrophorese-Reinheit größer als 98 %
2.Amplifikationsempfindlichkeit, Chargenkontrolle, Stabilität
3.Nachdem 1 U UNG 2 Minuten lang bei 50 °C behandelt wurde, sollte die Vorlage mit U unter 103 Kopien vollständig abgebaut sein und es kann kein Amplifikationsprodukt hergestellt werden
4.Keine exogene Nukleaseaktivität
Anweisungen
| Komponenten | Volumen (μL) | Endgültige Konzentration |
| 10 × PCR-Puffer (dNTP-frei, Mg²).+frei) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ersetzt dTTP) | - | 200–600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × GrundierungsmischungA | 2 | 1× |
| Vorlage | - | <1μg/Reaktion |
| ddH₂O | Bis 50 | - |
Notiz: a: Bei Verwendung für qPCR/qRT-PCR sollte die Fluoreszenzsonde dem Reaktionssystem hinzugefügt werden.Normalerweise kann eine Endkonzentration des Primers von 0,2 μM gute Ergebnisse liefern;Bei schlechter Reaktionsleistung kann die Primerkonzentration im Bereich von 0,2–1 μM eingestellt werden.Normalerweise wird die Sondenkonzentration im Bereich von 0,1–0,3 μM optimiert.Konzentrationsgradientenexperimente können durchgeführt werden, um die beste Kombination aus Primer und Sonde zu finden.
Anmerkungen
1.Das UNG-Enzym kann verwendet werden, um die kontaminierten dUTP-Amplifikationsprodukte vor der PCR-Amplifikationsreaktion aus dem Reaktionssystem zu entfernen und so falsch positive Ergebnisse aufgrund einer Produktkontamination zu vermeiden.
2.Die optimale Temperatur für die Verwendung des UNG-Enzyms in der Anti-Kontaminations-PCR-Reaktion beträgt im Allgemeinen 50 °C für 2 Minuten;Die Inaktivierungsbedingung beträgt 95 °C für 5 Minuten.
3.Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen und setzen Sie es keinen großen Temperaturschwankungen aus.
4.Verschiedene zu amplifizierende Gene weisen eine unterschiedliche Nutzungseffizienz von dUTP und eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem UNG-Enzym auf. Wenn die Verwendung des UNG-Systems daher zu einer Verringerung der Nachweisempfindlichkeit führt, sollte das Reaktionssystem angepasst und optimiert werden. Wenn Sie technische Unterstützung benötigen, wenden Sie sich bitte an unser Unternehmen.
