Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (Antikörpermodifikation) ist eine thermostabile Hotstart-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus YT-1, die eine 5′→3′-Polymeraseaktivität und eine 5′-Flap-Endonukleaseaktivität besitzt.Die Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase ist eine Taq-DNA-Polymerase, die durch thermolabile Taq-Antikörper modifiziert wird.Die Antikörpermodifikation erhöhte die Spezifität, Empfindlichkeit und Ausbeute der PCR.
Komponenten
| Komponente | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq-Puffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (Antikörper modifiziert) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Anwendungen
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 bei 25℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 und 50 % Glycerin.
Lagerbedingungen
Transport unter 0 °C und Lagerung bei -25 °C bis -15 °C.
Einheitendefinition
Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 15 nmol dNTP in 30 Minuten bei 75 °C in säureunlösliches Material einbaut.
Qualitätskontrolle
1.EndOnuklease-Aktivität:Die 4-stündige Inkubation von 20 U Enzym mit 4 μg pUC19-DNA bei 37 °C führte laut Gelelektrophorese zu keinem nachweisbaren Abbau der DNA.
2.5 kb Lambda-PCR:25 Zyklen der PCR-Amplifikation von 5 ng Lambda-DNA mit 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase in Gegenwart von 200 µM dNTPs und 0,2 µM Primern führen zum erwarteten 5-kb-Produkt.
3.Exonuklease-Aktivität:Die 30-minütige Inkubation einer 50-µl-Reaktion mit mindestens 12,5 U Taq-DNA-Polymerase mit 10 nmol 5´-FAM-Oligonukleotid bei 37 °C führt zu keinem nachweisbaren Abbau.
4.RNase-Aktivität:Die zweistündige Inkubation einer 10-µL-Reaktion mit 20 U Enzym mit 1 µg RNA-Transkripten bei 37 °C führte laut Gelelektrophorese zu keinem nachweisbaren Abbau der RNA.
5.Hitzeinaktivierung:NEIN.
Reaktionssystem
| Komponenten | Volumen |
| Template-DNAa | Optional |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP-Mix (jeweils 10 mM) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq-Puffer | 5 μL |
| Taq-DNA-PolymeraseB(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nukleasefreies Wasser | Bis zu 25 μL |
Anmerkungen:
1) a.
| DNA | Menge |
| Genomisch | 1 ng-1 μg |
| Plasmid oder Virus | 1 pg-1 ng |
2) b.Die optimale Konzentration der Taq-DNA-Polymerase kann bei speziellen Anwendungen zwischen 5 und 50 Einheiten/ml (0,1 bis 0,5 Einheiten/25 µl Reaktion) liegen.
Thermocycling-Protokoll
PCR
| Schritt | Temperatur(°C) | Zeit | Fahrräder |
| Erstdenaturierunga | 95 ℃ | 1-3 Min | - |
| Denaturierung | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Zyklen |
| GlühenB | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Verlängerung | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Letzte Erweiterung | 68 ℃ | 5 Minuten | - |
Anmerkungen:
1) Eine anfängliche Denaturierung von 1 Minute bei 95 °C ist für die meisten Amplifikationen ausreichend.Für schwierige Vorlagen wird eine längere Denaturierung von 2–3 Minuten bei 95 °C empfohlen.Bei der Kolonie-PCR wird eine anfängliche 5-minütige Denaturierung bei 95 °C empfohlen.
2) Der Glühschritt dauert typischerweise 15–60 s.Die Annealing-Temperatur basiert auf der Tm des Primerpaars und beträgt typischerweise 45–68 °C.
