Mini-Kit zur DNA-Extraktion

Lagerbedingungen

Bei -15 bis -25 °C lagern und bei Raumtemperatur transportieren.

Komponenten

Puffer-BIP:DNA-Bindungspuffer.

Puffer-GW:Waschpuffer;Fügen Sie vor der Verwendung absolutes Ethanol in der auf der Flasche angegebenen Menge hinzu.

Elutionspuffer:Elution.

FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-Adsorptionssäulen.

Sammelröhrchen 2 ml:Sammelröhrchen für Filtrat.

Vorbereitete Materialien

1,5 ml sterilisierte Röhrchen, absolutes Ethanol und Isopropanol (bei DNA-Fragment ≤100 bp 1 Volumen hinzufügen).

Isopropanol auf 1 Volumen Gel), Wasserbad.

Experimentierprozess

Geben Sie vor der Verwendung 80 ml Ethanol hinzu, um Puffer GW wie auf dem Etikett angegeben zu verdünnen, und lagern Sie es bei Raumtemperatur.

Mechanismus

1. PCR-Reaktionslösung

Gel-Extraktionsschema: Gleiches Volumen an Puffer hinzufügen. GDP-PCR-Reaktionslösungs-Wiederherstellungsschema:Fügen Sie das 5-fache Volumen Puffer hinzu

2. BIP Berechnen Sie das Gelvolumen (100).  μl entspricht 100 mg )

Gel auflösen

3. Auf 50–55 °C vorheizen℃

4. Wäsche binden

Fügen Sie 300 μl Puffer-GDP hinzu*

Fügen Sie 700 μL Puffer GW hinzu

Fügen Sie 700 μL Puffer GW hinzu

5. Eluieren

Fügen Sie 20 – 30 μl Elutionspuffer oder entionisiertes Wasser hinzu

Hinweise* Rückgewinnung der PCR-Reaktionsflüssigkeit ohne diesen Schritt

Gel-Extraktionsprogramm

1. Schneiden Sie nach der DNA-Elektrophorese zur Fraktionierung der DNA-Fragmente den einzelnen Streifen des DNA-Fragments unter UV-Licht aus dem Agarosegel aus.Es wird empfohlen, saugfähiges Papier zu verwenden, um die scheinbare Feuchtigkeit des Gels aufzusaugen und die Größe der Gelscheibe zu minimieren, indem überschüssige Agarose so weit wie möglich entfernt wird.Wiegen Sie die Gelscheibe (ohne Mikrozentrifugenröhrchen), um ihr Volumen zu berechnen: Das Volumen einer 100-mg-Gelscheibe beträgt etwa 100 μL, vorausgesetzt, die Dichte beträgt 1 g/ml.

2. Geben Sie das gleiche Volumen Puffer GDP hinzu und inkubieren Sie es 7–10 Minuten lang bei 50–55 °C (passen Sie die Inkubationszeit je nach Gelgröße an, bis sich das Gel vollständig aufgelöst hat).Drehen Sie das Röhrchen während der Inkubation zweimal um.

Δ Die Zugabe von 1–3 Volumina Puffer-GDP hat keinen Einfluss auf die DNA-Rückgewinnungseffizienz.Wenn das wiederherzustellende DNA-Fragment <100 bp ist, müssen 3 Volumina Puffer-GDP hinzugefügt werden;Wenn sich die Gelscheibe vollständig aufgelöst hat, geben Sie 1 Volumen Isopropanol hinzu und mischen Sie gründlich, dann fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.

3. Zentrifugieren Sie kurz, um die Probe auf den Boden des Röhrchens zu bringen, setzen Sie die FastPure DNA Mini Columns-G in die 2-ml-Sammelröhrchen ein und übertragen Sie die Lösung vorsichtig, maximal 700 μl, einmal pro Woche

Zeit zu den Filtrationssäulen, 30–60 Sekunden lang bei 12.000 U/min (13.800 x g) zentrifugieren.

4. Entsorgen Sie das Filtrat und geben Sie 300 μl Puffer GDP auf die Säule, inkubieren Sie es 1 Minute lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie es 30–60 Sekunden lang bei 12.000 U/min (13.800 x g).

5. Entsorgen Sie das Filtrat und geben Sie 700 μl Puffer GW (überprüfen Sie, ob vorher absolutes Ethanol hinzugefügt wurde!) in die Säule und zentrifugieren Sie 30–60 Sekunden lang bei 12.000 U/min (13.800 x g).

Δ Bitte geben Sie Puffer GW um die Wand der Adsorptionssäule herum oder fügen Sie Puffer GW auf der Rückseite hinzu und mischen Sie es zwei- bis dreimal kopfüber, um das an der Röhrchenwand anhaftende Salz vollständig auszuspülen.

6. Wiederholen Sie Schritt 5.

Δ Durch zweimaliges Spülen mit Puffer GW kann sichergestellt werden, dass das Salz vollständig entfernt wird und die Auswirkungen auf nachfolgende Experimente vermieden werden.

7. Entsorgen Sie das Filtrat und zentrifugieren Sie die leere Säule 2 Minuten lang bei 12.000 U/min (13.800 x g).

8. Setzen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein, geben Sie 20–30 μl Elutionspuffer in die Mitte der Säulenmembran, inkubieren Sie 2 Minuten lang und zentrifugieren Sie dann 1 Minute lang bei 12.000 U/min (13.800 x g).Entsorgen Sie die Säule und lagern Sie die erhaltene DNA bei -20 °C.

Δ Das Übertragen des Überstands aus Schritt 8 auf die Säule zur erneuten Elution und das Vorwärmen des Elutionspuffers auf 55 (wenn das DNA-Fragment >3 kb ist) kann hilfreich sein, um die Rückgewinnungseffizienz zu erhöhen.

Programm zur Wiederherstellung von PCR-Produkten

Dieses Protokoll ist anwendbar auf die Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Produkten, enzymatischen Reaktionssystemen und anderen DNA-Rohprodukten (einschließlich genetischer DNA).Diese Lösung kann verschiedene Nukleotide, Primer, Primerdimere, Salzmoleküle, Enzyme und andere Verunreinigungen effizient entfernen.

1. PCR-Produkte, enzymatische Reaktionslösung und andere DNA-Rohprodukte kurz zentrifugieren.Schätzen Sie ihr Volumen mit einer Pipette ab und übertragen Sie es in ein sterilisiertes 1,5-ml- oder 2-ml-Röhrchen.Fügen Sie ddH2O hinzu, bis das Volumen 100 μL erreicht;Bei genomischer DNA mit hoher Konzentration hilft die Verdünnung auf 300 μl mit ddH2O hingegen, die Rückgewinnungseffizienz zu verbessern.

2. 5 Volumina Buffer GDP hinzufügen und gründlich durch Umdrehen oder Vortexen mischen.Wenn das interessierende DNA-Fragment >100 bp ist, müssen zusätzliche 1,5 Volumina (Proben + Puffer-GDP) Ethanol hinzugefügt werden.

3. Setzen Sie die Säule wieder in das Sammelröhrchen ein, übertragen Sie die Mischung direkt auf die Säule und zentrifugieren Sie sie 30 – 60 Sekunden lang bei 12.000 U/min (13.800 × g).Wenn das Volumen der gemischten Lösung >700 µL beträgt, setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das Sammelröhrchen ein, übertragen Sie die verbleibende Lösung auf die Adsorptionssäule und zentrifugieren Sie sie 30 – 60 Sekunden lang bei 12.000 U/min (13.800 × g).

4. Die nächste Leistung bezieht sich auf die Schritte 5 – 8 des 08-1/Gel-Extraktionsprogramms.